Otoradyografi, spesifik radyoligand kullanarak dokularda protein bağlayıcı bölgelerin dağılımını inceleyen güçlü ve basit bir tekniktir. Ayrıca immünohistokimyaya da uygun bir alternatif. Bu teknik, geleneksel film pozlama daha hızlı dijital görüntüler ile mekansal çözünürlük ile protein ifade görselleştirir.
Ayrıca protein hedeflerinin farmakolojik analizi için de kullanılabilir. Bu yöntem, cam üzerine monte edilmiş fare dokularını içerir, ancak diğer türlere, hatta kapaklarda yetişen hücrelere de uzatılabilir. Prosedürü göstermek Nane Griem-Krey, benim laboratuvarda bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır.
Başlamak için, onu dondurmak için toz kuru buz doku batırın. Donmuş dokuyu doğrudan eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostata aktarın. Doku eksi 20 santigrat derece ye 20 dakika kriyostat alışmak sağlar.
Daha sonra doku tutucuyu kriyostat dışında katıştırma ortamı ile kapatın ve gömme ortamı hala sıvıyken dondurulmuş doku örneğini hızlı bir şekilde istenilen yönde yerleştirin. Doku tutucuyu kriyostat'a geri aktarın ve katıştırma ortamını sertleşme için eksi 10 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklara maruz bırakın. Doku tutucuyu kriyostat mikrotomuna yerleştirin.
Eğimli kesitlerden kaçınmak için dokunun yönünü ayarlayın. İstenilen kalınlıkta bölümlerde stereotaksik bir atlas ın rehberliğinde dokuyu kesin ve gerekirse küçük bir fırça ile kesiti açın. Çözülme bölümü mikroskop slayt üzerine monte edin.
Daha sonra istenilen teknik tekrar için ilgi bölgesinden bölümleri sırayla toplayın. Slaytlar üzerindeki bölümlerin daha fazla işleme konmadan önce bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Sertifikalı bir radyoaktivite laboratuvarında, slaytları deneysel koşullarla etiketlemek için bir kalem kullanın.
Slaytları yatay olarak plastik tepsilere yerleştirin. Slaytlara monte edilen bölümlere, söz konusu hedefe ayarlanmış uygun bir SA arabelleği hacmini dikkatlice uygulayın. Her bölümün tamamen kapalı olduğundan emin olun.
Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketlenmemiş bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek SA tampon. Daha sonra buharlaşmayı önlemek için tepsileri kapaklarla kapatın. 20 rpm olarak ayarlanmış bir plaka shaker üzerinde 30 dakika boyunca ilgili bir sıcaklıkta pre-incubate.
Daha sonra, her slayttan kuluçka öncesi sıvıyı dökün ve slaytları plastik tepsiye geri aktarın. Hemen sa tampon radyoligand ilgili konsantrasyon ile tamamen bölümleri kaplayın. Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketli olmayan bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek radyoligand çözeltisi.
20 rpm sürekli nazik sallayarak istenilen koşullar altında kapaklar ve kuluçka ile tepsiler kapağı. Bundan sonra, kuluçka çözeltisini dökün ve slaytları bir mikroskop slayt rafına aktarın. Hemen slaytları yıkayın.
GHB protokolü için, 20 saniye boyunca buz gibi SA tamponuyla iki kez yıkayın ve slayt rafını buz gibi distile su yla dolu tepsilere daldırarak iki kez durulayın. Slaytları raflarda dikey olarak yerleştirin ve en az bir saat kuru havalayın. Daha sonra slaytları oda sıcaklığında gece fiksasyonu için paraformaldehit içeren bir fiksatöre aktarın.
Ertesi gün, oda sıcaklığında silika jel içeren bir kurutucu kutusuna slaytlar aktarın. Nemi ortadan kaldırmak için slaytları kurutucu kutuda üç saat bekletin. İlk olarak, doku yukarı bakacak şekilde radyasyon korumalı görüntüleme plaka kasetiçine bölümleri yerleştirin.
Radyoligve bağlama sonraki nicelik için her kasetbir radyoaktif mikroölçek ekleyin. Kullanımdan hemen önce trityuma duyarlı fosfor görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesine yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre görünür kızılötesi ışığa maruz bırakın. Daha sonra görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesinden çıkarın ve hemen kasetteki bölümlere yerleştirin.
Kasetin tamamen kapalı olduğundan emin olun. Işıktan korunurken oda sıcaklığında optimize edilmiş pozlama süresi için bölümleri fosfor görüntüleme plakasına maruz bırakın. Pozlamadan sonra, karanlıkta kaseti dikkatlice açın ve görüntüleme plakasını hemen fosfor görüntüleyicisinin karanlık kutusuna aktarın.
Dijital görüntü elde etmek için plakayı mümkün olan en yüksek çözünürlükte taz.yama. Başlamak için uygun bir görüntü analizi programı açın. Menü öğesi bölge belirlemesini seçerek her kalibrasyon standardı için göreli optik yoğunlukları belirleyin.
Bölge oluşturma aracını seçin ve radyoaktif mikro ölçeğin her noktası için eşit boyutta bir alan seçmek için kullanın. Menü öğesi etiketinin altındaki numaraya tıklayarak seçili her alana bir sayı atayın. Kalibrasyon standardının her noktası için OD değerlerini dışa aktarmak için Dosya Dışa Aktarma ve ardından 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.
Tescilli görüntüleme yazılımında, her bölümdeki ilgi çekici bölgeyi seçmek ve otoradyogramların niceliğini gerçekleştirmeye başlamak için oD'lerini ölçmek için bir bölge oluşturma aracı kullanın. İlgi alanı için bir şablon oluşturarak her bölümde aynı bölgeyi seçin ve kopyalayın ve her otoradyogramdaki beyin anatomisindeki küçük varyasyonlara göre ayarlayın. Bundan sonra, rod değerlerini ve seçili alanların boyutlarını elektronik tabloya aktarmak için Dosya Dışa Aktar 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.
Metin protokolünde belirtildiği gibi radioligand'ın bağlayıcılığı belirleyin. Bu çalışmada, yüksek afinite GHB bağlama sitelerinin anatomik dağılımı, koronal, sagital ve yatay kesitler halinde kesilmiş bir fare beyninde radyoetiketli GHB analog radyoaktif HOCPCA ile görselleştirilmiştir. Hipokampus ve kortekste yüksek düzeyde bağlama görülürken striatumda daha düşük bağlama düzeyleri görülür ve beyincikte bağlayıcılık saptanmaz.
Burada gösterildiği gibi, anatomik yapılar farklı düzlemler kullanılarak görselleştirilebilir ve anatomik bütünlük cresyl menekşe boyama ile desteklenebilir. Bir sıçan, fare ve bir domuzun temsili otoradyogramları memeli beynindeki yüksek yakınlıklı GHB ciltleme alanlarının evrimsel korumasını göstermektedir. Radyoaktif HOCPCA bağlama siteleri aralarında brüt beyin anatomisi karşılaştırma sağlayan her üç tür tespit edilir.
Yüksek afinite GHB bağlama siteleri, bağlayıcı sitelere farklı yakınlıklar gösteren ancak benzer özel faaliyetler gösteren GHB radyoligandlarla incelenir. Radyoaktif HOCPCA yüksek hassasiyet ve gürültü oranına mükemmel sinyal ile donatılmıştır. Radyoaktif NCS-382'nin daha düşük hassasiyeti nedeniyle benzer düzeyde bağlama elde etmek için daha yüksek radyoligve konsantrasyonlar kullanılmalıdır.
Daha yüksek radyoligand konsantrasyonları radyoaktif GHB karşılaştırılabilir bağlama düzeyleri elde etmek için gereklidir. Ancak, daha yüksek radyoligand konsantrasyonları da gürültü oranı daha düşük bir sinyal ile spesifik olmayan bağlama düzeyini artırmak. Gürültü oranlarına en iyi sinyali almak için radyoligand konsantrasyonu, yıkama ve maruz kalma süresi gibi ar-ge koşullarını optimize etmek önemlidir ve daha önce plakayı silmeyi hatırlamak da çok önemlidir.
Prosedür keşif projeleri için yararlı olabilir canlı bir hayvan bileşik bağlama hakkında bir fikir almak için in vivo koşullara uzatılabilir. Sertifikalı tam radyoaktif malzeme ile bir laboratuvarda çalışmayı unutmayın ve radyoaktivite veya paraformaldehit kullanırken koruyucu giysiler giymek.
