Ауторадиография является мощным и простым методом для изучения распределения белковых связывающих участков в тканях с использованием конкретных радиолиганда для цели. Это также подходящая альтернатива иммуногистохимии. Этот метод визуализирует экспрессию белка с пространственным разрешением с помощью цифровых изображений, что быстрее, чем традиционная экспозиция пленки.
Он также может быть использован для фармакологического анализа белковых целей. Метод включает в себя ткани мыши, установленные на стекле, но могут быть распространены на другие виды или даже на клетки, выращенные на обложках. Демонстрация процедуры будет Нан Грем-Крей, аспирант в моей лаборатории.
Для начала погрузим ткань в порошкообразный сухой лед, чтобы заморозить его. Перенесите замороженную ткань непосредственно в криостат, который установлен до минус 20 градусов по Цельсию. Пусть ткань акклиматизироваться до минус 20 градусов по Цельсию в криостате в течение 20 минут.
Затем накройте держатель ткани встраиванием среды за пределами криостата и быстро поместите образец замороженной ткани в нужную ориентацию, в то время как среда встраивания все еще является жидкой. Передача держателя ткани обратно в криостат и подвергать встраивания среды до температуры ниже минус 10 градусов по Цельсию для затвердевания. Распоить держатель ткани в микротоме криостата.
Отрегулируйте ориентацию ткани, чтобы избежать наклонных секций. Вырезать ткани с руководством стереотаксис атласа в разделах желаемой толщины и разворачивать раздел с небольшой кистью, если это необходимо. Оттепель монтирует секцию на слайд микроскопа.
Затем последовательно собирать разделы из области, представляющие интерес для желаемого технического повторения. Разрешить разделы на слайдах в воздух сухой в течение одного часа до дальнейшей обработки. В сертифицированной лаборатории радиоактивности используйте карандаш для обозначения слайдов экспериментальными условиями.
Поместите слайды горизонтально в пластиковые подносы. Тщательно примените соответствующий объем буфера SA, скорректированного под соответствующую цель, к разделам, установленным на слайдах. Убедитесь, что каждый раздел полностью покрыт.
Для определения неспецифической привязки дополните буфер SA соответствующей концентрацией неоцеливого соединения. Затем накройте лотки крышками, чтобы избежать испарения. Предварительно инкубировать при соответствующей температуре в течение 30 минут на тарелке шейкер установлен до 20 об/мин.
Затем слейте жидкость перед инкубацией с каждого слайда и перенесите слайды обратно в пластиковый лоток. Немедленно покройте разделы вполне с уместной концентрацией radioligand в буфере SA. Для определения неспецифической обязательной, дополнить радиолиганда решение с соответствующей концентрацией неоцеливого соединения.
Накройте лотки крышками и инкубировать в желаемых условиях с постоянной нежной тряской при 20 об/мин. После этого слейте инкубационный раствор и перенесите слайды в стойку слайда микроскопа. Немедленно вымойте горки.
Для протокола GHB, мыть дважды с ледяной SA буфер в течение 20 секунд, а затем промыть дважды, окунув слайд стойку в лотки заполнены ледяной дистиллированной воды. Распоистите слайды вертикально в стеллажах и высушите воздух не менее одного часа. Затем перенесите слайды на фиксатор, содержащий параформальдегид для ночной фиксации при комнатной температуре.
На следующий день перенесите слайды в коробку с кремнием, содержащую кремнеземный гель при комнатной температуре. Оставьте горки в коробке децикатора на три часа, чтобы устранить влагу. Во-первых, поместите секции в кассету с радиационной экранной пластиной с тканью вверх.
Включите радиоактивный микромасштаб в каждую кассету для последующей количественной оценки радиолигандовой привязки. Непосредственно перед использованием загрузите чувствительный к тритию фосфорную пластину в машину для визуализации фосфора и подвергайте ее видимому инфракрасному свету в соответствии с инструкциями производителя по его удалению. Затем снимите пластину с фосфорной визуализации машины и сразу же поместите ее на секции в кассете.
Убедитесь, что кассета закрыта полностью. Выставить секции на фосфорную пластину для оптимизированного времени экспозиции при комнатной температуре при защите от света. После экспозиции осторожно откройте кассету в темноте и немедленно перенесите пластину изображения в темную коробку фосфорного изображения.
Сканирование пластины в максимально возможном разрешении для получения цифрового изображения. Для начала откройте соответствующую программу анализа изображений. Определите относительную оптическую плотность для каждого стандарта калибровки, выбрав определение региона пункта меню.
Выберите инструмент для создания региона и используйте его для выбора области равного размера для каждой точки радиоактивного микромасштаба. Назначьте номер каждой выбранной области, нажав на номер под меткой пункта меню. Нажмите «Экспорт файлов», а затем отчет о 2D-регионе для экспорта значений OD для каждой точки стандарта калибровки.
В проприетарном программном обеспечении визуализации используйте инструмент создания региона для выбора области, интересной для каждого раздела, и измерения его ODs, чтобы начать количественную оценку авторадиограмм. Выберите один и тот же регион в каждом разделе, создав шаблон для области интереса и скопировать и настроить его на незначительные изменения в анатомии мозга в каждой авторадиограмме. После этого нажмите Отчет об экспорте файлов 2D-региона для экспорта значений ROD и размеров выбранных областей в электронную таблицу.
Определите привязку радиолиганда, изложенную в текстовом протоколе. В этом исследовании анатомическое распределение сайтов связывания GHB высокого сродства визуализируется с помощью радиозапоможенных аналогов GHB радиоактивных HOCPCA в мозге мыши, который был разрезан на корональные, сагиттаальные и горизонтальные секции. Высокие уровни связывания видны в гиппокампе и коре головного мозга, в то время как более низкие уровни связывания видны в стриатуме и не обнаруживается связывание в мозжечках.
Как показано здесь, анатомические структуры могут быть визуализированы с использованием различных плоскостей и анатомической целостности может быть поддержана cresyl фиолетовый окрашивания. Репрезентативные авторадиограммы крысы, мыши и свиньи иллюстрируют эволюционное сохранение высоких сродства GHB связывающих участков в мозге млекопитающих. Радиоактивные места связывания HOCPCA обнаружены во всех трех видах, что позволяет сравнивать грубую анатомию мозга между ними.
Высокое сродство GHB связывающих сайтов зондов с GHB radioligands, которые отображают различные сходства для связывающих сайтов, но сопоставимые конкретные виды деятельности. Радиоактивная HOCPCA наделена высокой чувствительностью и отличным соотношением сигнала к шуму. Из-за более низкой чувствительности радиоактивных NCS-382, более высокие концентрации радиолиганда должны быть использованы для того, чтобы получить аналогичные уровни связывания.
Еще более высокие концентрации радиолиганда необходимы для достижения радиоактивных ПГВ сопоставимых обязательных уровней. Однако более высокие концентрации радиолиганда также повышают уровень неспецифической привязки с последующим более низким соотношением сигнала к шуму. Важно оптимизировать условия анализа, такие как концентрация радиолиганда, стирка и время экспозиции, чтобы получить лучший сигнал к шумовым соотношениям, и это также очень важно помнить, чтобы стереть пластину раньше.
Процедура может быть распространена на условия in vivo, чтобы получить представление о соединении связывания в живом животном, которые могут быть полезны для проектов открытия. Не забудьте работать в лаборатории с сертифицированным полноценным радиоактивным материалом и носить защитную одежду при обращении с радиоактивностью или параформалдегидом.
