البروستاتا organoids هي مثيرة في المختبر نظام لدراسة التنمية والمرض. أنها التغلب على التحديات من خطوط الخلايا الخالدة وتقديم بديل غير مكلفة لنماذج الحيوانات. يمكن زراعتها من خلايا البروستاتا البشرية ، كما أظهرنا في هذا البروتوكول ، وكذلك خلايا البروستاتا الماوس ، كنظام نموذج ما قبل السريرية ذات الصلة بالمرض.
وقد وصفت العديد من المختبرات أساليب الثقافة المفيدة ونقاط النهاية. ولكننا نأمل في جمع تلك التفاصيل معا في بروتوكول واحد وإظهار الخطوات الصعبة بشكل خاص للمستخدمين الجدد. كما تحسين التقنيات، يمكن زراعة organoids سرطان البروستاتا من عينات المرضى كنهج الطب الدقيق لنموذج المرض والاستجابة للعلاجات.
ظروف الثقافة هي محددة لعضيات البروستاتا، ولكن تم تكييف العديد من نقاط النهاية من أنواع الأنسجة الأخرى. يمكن للمستخدم تكييف أجزاء من هذا البروتوكول لنوع الخلية الخاصة بهم من الفائدة. ابدأ هذه التجربة بزراعة الخلايا الظهارية في مصفوفة هلامية مرمزة 96-آبار كما هو موضح في المخطوطة.
لجمع الأعضاء من اللوحات بعد 12 يوما، وإزالة المتوسطة من الآبار دون إزعاج هلام مصفوفة. ثم نضيف على الفور حوالي 200 ميكرولترات من البروتياز المحايد لكل بئر في حوالي نسبة واحد إلى اثنين من هلام المصفوفة إلى البروتياز المحايد. احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ثم الماصة صعودا وهبوطا إلى تفكيك ميكانيكيا الخليط، واحتضان مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، نقل خليط الخلية الهلامية مصفوفة مصفوفة محايدة من بضعة آبار إلى أنبوب microcentrifuge. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 مرات ز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
إزالة فائقة، وحفظ بيليه organoid لتحليلات لاحقة. لإنشاء قوالب لتضمينها، قطع قسم صغير من 1، 000 مايكرولتر ماصة تلميح لجعل اسطوانة التي تحتوي على 50 ميكروليترس. ثم من الجزء الأوسع من نفس الطرف، وجعل القالب أوسع الثانية التي تناسبها حول القالب الأول.
لإنشاء كتلة الباردة، التفاف على الجليد مع الشريط مع الجانب لاصقة حتى. ثم تلتزم القوالب عموديا على الشريط. لتضمين organoids في سد هلام الأنسجة للمعالجة، أولا غسل بيليه organoid التي تم الحصول عليها سابقا مع ملليلتر واحد من هانك حل الملح المتوازن.
بعد الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق، وإزالة supernatant. ثم إضافة 30 إلى 50 ميكرولترات من هلام الأنسجة السائلة إلى بيليه organoid، ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا لإعادة بناء بيليه. نقل هذا الخليط إلى قالب على كتلة الباردة، والسماح للعينة لتبرد وتتوطد في المكونات.
بعد ذلك ، استخدم المكبس لدفع المكونات من القالب الصغير وإلى وسط القالب الأكبر ، وملء ذلك عن طريق الأنابيب واضحة 2 ٪ agar حول المكونات. لوضع علامة على الجزء العلوي من العينة، ماصة صبغ صبغة 2٪ agar على رأس المكونات. مرة واحدة وقد تبريد أجار، واستخدام المكبس لنقل المكونات في كاسيت الأنسجة.
تسمية كاسيت مع قلم رصاص ووضعها في 10٪ غير محايد buffered formalin لتثبيت بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل كاسيت من 10٪ محايد buffered formalin إلى 70٪ الإيثانول الصف النسيجي, ومعالجتها أكثر وتضمين في البارافين. تبدأ من خلال تقليم قاعدة كتلة في سمك 10 ميكرومتر.
بمجرد ظهور مقطع يحتوي على منطقة المكونات، توقف عن التشذيب. قفل الدوار microtome، ونقل كتلة مرة أخرى على الجليد للاسترخاء. نقل النصل إلى جزء جديد غير مستخدم.
ونقل كتلة العودة إلى المشبك. فتح الجهاز والبدء في التشذيب في خمسة ميكرومتر لكل قسم. استخدام ملاقط لنقل القسم إلى حمام الماء 40 درجة مئوية، والسماح لها بالانتشار.
تراجع شريحة عموديا في الماء لنقل القسم على ذلك. ثم لاحظ الشريحة تحت مجهر حقل مشرق لضمان وجود organoid في القسم. خبز بين عشية وضحاها في 45 إلى 50 درجة مئوية، ومن ثم المضي قدما مع تلطيخ كما هو موضح في المخطوطة.
ابدأ هذا الجزء من التجربة بآبار غير مستخدمة من لوحة المصفوفة المغلفة بالهلام ذات الـ 96 بئرًا مع العضويات. بواسطة pipetting ضد جانب البئر، وترك الفضاء بين وسائل الإعلام ومصفوفة هلام، بعناية إزالة وسائل الإعلام أكبر قدر ممكن من دون تعطيل الثقافة organoid. استخدام قلصت 1، 000 ميكرولتر ماصة تلميح، قبل الرطب مع برنامج تلفزيوني لرسم قطرة واحدة من هلام مصفوفة التي تحتوي على organoids من الفائدة.
الاستغناء عن قطرة على منتصف شريحة غرفة. بالعين المجردة، تُشعّر الوسائط الزائدة و جل المصفوفة من شريحة الغرفة باستخدام ماصة دقيقة. لتعزيز الالتزام العضوي بالزجاج ومنع فقدان العينات أثناء خطوات الغسيل اللاحقة.
ضع الشريحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. الأنابيب ببطء لمنع الانفصال عن الطبق، إضافة 200 ميكرولترات من 1X PBS لغسل organoids لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. إزالة بعناية PBS 1X وإضافة 200 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde.
قم بإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. في PFA، قم بغسل خطوات permeabilization اللاحقة وتلطيخها كما هو موضح في هذا البروتوكول. جبل وصورة على الفور.
يظهر الشريحة الطازجة غير المطعّمة بوضوح أجهزة البروستاتا الأولية البشرية ، في حين أن في الشريحة الجافة غير المطهية ، تظهر الأجهزة العضوية شفافة ويصعب اكتشافها تحت مجهر ميداني مشرق. Hematoxylin وeosin تلطيخ يظهر كسر الجهاز البروستاتا الأولية البشرية من سوء المناولة، مثل الأنابيب العدوانية، بروتوكول معالجة خاطئ بالمقارنة مع organoid التعامل معها بشكل جيد. كان الجهاز الأساسي للبروتوستة البشرية ثابتًا ، وبارافين مدمجًا ، ومقطّوعًا ، وملطخًا بالستوكيراتين القاعدي 5 واللمّوقى cytokeratin 8 ، وbasal p63 وcytokeratin اللمّيّات ، وصورها بالمجهر confocal.
كان ملوثة كله محمولة على الجهاز العضوي البروستاتا الأولية الإنسان مع السيتوكيراتين القاعدية 5 أو السيتوكيراتين اللمبّر 8، ومضادة مع phalloidin وDAPI، وصور مع المجهر confocal. تم تلطيخ خلية البروستاتا الأولية البشرية كاملة مع Edu المسمى بالفلورسنت وموازن مع Hoescht ، وصور مع المجهر confocal. من المهم تصور الأعضاء طوال العملية.
بعد جمع المقاطع، تأكد من تصور العينات على الشريحة، وتأكد من مراقبة organoids أثناء تركيب كامل. بعد جمع الأعضاء من هلام المصفوفة، يمكنك تركيبها بالكامل واستخدام المقايسات التجارية، أو فصل إلى خلايا واحدة لتسلسل التدفق الخلوي أو خلية واحدة. توفر الثقافة ثلاثية الأبعاد للباحثين طريقة جديدة لدراسة الأنسجة في إعداد طبق المختبر.
يمكن تطبيقه على تكوين الأعضاء ، أو لفهم أمراض مرض المريض. عند العمل مع عينات المريض، دائماً توخي الحذر والتعامل مع المواد كإمكانية للتعرض مسببات الأمراض المنقولة بالدم.
