Органоиды простаты являются захватывающей системой in vitro для изучения развития и болезней. Они преодолевают трудности увековеченных клеточных линий и предлагают недорогую альтернативу моделям животных. Они могут быть выращены из клеток простаты человека, как мы показали в этом протоколе, а также клетки предстательной железы мыши, как болезнепролевая доклиническая модель системы.
Многие лаборатории описали полезные методы культуры и конечные точки. Но мы надеемся объединить эти детали в один протокол и продемонстрировать особенно сложные шаги для новых пользователей. По мере того как методы улучшают, органоиды рака простаты можно вырасти от образцов пациента как подход микстуры точности к заболеванию модели и реакции к терапии.
Культурные условия специфичны для органоидов простаты, однако многие из конечных точек были адаптированы из других типов тканей. Пользователь может адаптировать часть этого протокола к своему типу ячейки. Начните этот эксперимент с выращивания эпителиальных клеток в матричных гелях, закодированных 96-колодец пластин, как описано в рукописи.
Для сбора органоидов из пластин через 12 дней, удалить средний из скважин, не нарушая матричного геля. Затем сразу же добавить около 200 микролитров нейтральной протеазы к каждому хорошо примерно один-два соотношения матричного геля к нейтральной протеазы. Инкубировать пластину в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию.
Затем пипетка вверх и вниз, чтобы механически разобщить смесь, и инкубировать снова в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. После инкубации перенесите нейтральную матричную гель-клеточную смесь протеазы из нескольких скважин в микроцентрифугную трубку. Пеллет клетки центрифугации в 300 раз г в течение трех-пяти минут.
Удалите супернатант и сохраните органоидные гранулы для последующего анализа. Чтобы создать формы для встраивания, вырежьте небольшой участок 1000-микролитровый наконечник пипетки, чтобы сделать цилиндр, который вмещает 50 микролитров. Затем из более широкой части того же кончика, сделать второй более широкой формы, которая подходит вокруг первой формы.
Чтобы создать холодный блок, оберните ледяной пакет лентой с клейкой стороной вверх. Затем придерживаться формы перпендикулярно ленты. Чтобы встроить органоиды в гистологический гель для обработки, сначала вымойте ранее полученные органоидные гранулы одним миллилитром сбалансированного соленого раствора Хэнка.
После центрифугирования при 300 раз г в течение трех-пяти минут, удалить супернатант. Затем добавьте от 30 до 50 микролитров жидкого гистологического геля в органоидные гранулы и аккуратно перемешайте, медленно трубя вверх и вниз, чтобы повторно использовать гранулы. Перенесите эту смесь в форму на холодный блок, и дайте образцу остыть и затвердеть в вилку.
Далее, используйте поршень, чтобы нажать вилку из небольшой формы и в центре большей плесени, и заполнить его путем трубопроводов ясно 2%agar вокруг вилки. Чтобы отметить в верхней части образца, пипетка гистологических красителей тонированные 2%agar на верхней части вилки. После того, как агар остынет, используйте поршень для передачи вилки в гистологическую кассету.
Этикетка кассеты с карандашом и поместите его в 10%neutral буферных формалин для ночной фиксации. На следующий день перенесите кассету с 10%нейтрального буферного формалина на 70% гистологического этанола, и обработать его дальше и встроить в парафин. Начните с обрезки основания блока толщиной 10 микрометров.
Как только появится раздел, содержащий область вилки, прекратите обрезку. Заблокировыв ротор микротома, и перенесите блок обратно на лед, чтобы охладиться. Перемести лезвие на новую, неиспользованную часть.
И перенесите блок обратно на зажим. Разблокировка машины и начать обрезку на пять микрометров на секцию. Используйте пинцет, чтобы перенести секцию на 40-градусную ванну с водой по Цельсию и дать ей разложиться.
Опустите слайд вертикально в воду, чтобы перенести раздел на него. Затем наблюдайте за слайдом под ярким полевым микроскопом, чтобы убедиться, что органоид присутствует в разделе. Выпекать на ночь при температуре от 45 до 50 градусов по Цельсию, а затем приступить к окрашивания, как описано в рукописи.
Начните эту часть эксперимента с неиспользованных колодцев 96-хорошо матричной гелеобразной пластины с органоидами. Путем pipetting против стороны хорошо, оставляя пространство между средствами массовой информации и матричного геля, тщательно удалить как можно больше средств массовой информации, как это возможно, не нарушая органоидной культуры. Используйте обрезанный 1000-микролитровый наконечник пипетки, предварительно мокрый с PBS, чтобы составить одну каплю матричного геля, который содержит органоиды, представляющие интерес.
Выпредельте падение на середину камерного слайда. Невооруженным глазом, аспирировать избыток средств массовой информации и матричного геля из камеры слайд с помощью тонкой наконечником пипетки. Поощрять присоединение органоидов к стеклу и предотвращать потерю образцов во время последующих шагов стирки.
Поместите горку в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 30-45 минут. Трубопровод медленно, чтобы предотвратить отслоение от блюда, добавить 200 микролитров 1X PBS для мытья органоидов в течение пяти минут при комнатной температуре с нежной тряской. Аккуратно удалите 1X PBS и добавьте 200 микролитров 4%paraformaldehyde.
Исправить в течение 30 минут при комнатной температуре с нежной тряской. В PFA, мыть и приступить к последующей протеабилизации и окрашивания шаги, как описано в этом протоколе. Гора и изображение немедленно.
Неокрашенные свежесрезанные слайды ясно показывают человека первичных органоидов простаты, в то время как в неокрашенных сухой слайд, органоиды появляются полупрозрачные и труднее обнаружить под ярким полевым микроскопом. Гематоксилин и эозин окрашивание показывает сломанной человеческой первичной простаты органоид от неправильного обращения, такие как агрессивные пипетки, неправильный протокол обработки по сравнению с хорошо обработанной органоид. Первичный органоид предстательной железы человека был формалин-фиксированный, парафин-встроенный, секционные, и окрашенные базальным цитокератин 5 и светящийся цитокератин 8, базальный p63 и светящийся цитокератин 8, и изображены с конфокальным микроскопом.
Цельно-установленный первичный органоид простаты человека был окрашен базальным цитокератином 5 или люминесцентным цитокератином 8, и противояльцем фаллоидином и ДАПИ, и изображен конфокальным микроскопом. Цельно-установленный человеческий первичный органоид клеток простаты был окрашен флуоресцентно помечены Эду и противоядие с Hoescht, и изображены с конфокального микроскопа. Важно визуализировать органоиды на протяжении всей процедуры.
После сбора разделов, убедитесь, что визуализировать образцы на слайде, и убедитесь, что вы наблюдаете органоидов во время цельного монтажа. После сбора органоидов из матричного геля, вы можете цельно-монтировать их и использовать коммерческие анализы, или отмежеваться от одиночных клеток для цитометрии потока или одноклеточного секвенирования. 3D культура предоставляет исследователям новый способ изучения тканей в условиях лабораторного блюда.
Он может быть применен к органогенезу, или к пониманию патологии болезни пациента. При работе с образцами пациента, всегда проявлять осторожность и обрабатывать материалы, как потенциал для воздействия патогенов, передающихся через кровь.
