Cavefish هو رفع كجداري حيوانية رائعة لفهم التطور والعمليات الطبية الحيوية. ونحن الآن نجري تحقيقات طبية بيولوجية باستخدام هذه الصفة كموازة من الأعراض البشرية. هنا سوف نظهر البطارية من السلوكيات المقايسة ونظام التحليل التي يمكن استخدامها لكل من الدراسات التطورية والطبية الحيوية.
إلى اهتزاز اختبار يجذب والسلوك، يتم إدخال قضيب الزجاج تهتز في وعاء زجاجي يحتوي على سمكة واحدة في الظلام. يتم تأقلم الأسماك قبل أربعة أيام من الفحص في الماء المتكيف مع دورة 12، 12 ضوء، الظلام. في اليوم السابق ليوم الفحص بعد ثلاثة أيام من التأقلم ، استبدل الماء في غرفة الفحص بالمياه الطازجة المكيفة.
في يوم الفحص ، يتم حرمان الأسماك من الطعام حتى بعد اكتمال الفحص ، لأن التوقف سيغير استجابتها للاهتزازات. إعداد جهاز انبعاث الاهتزاز عن طريق ضبط ل40 هيرتز. تعيين معلمات التسجيل المناسبة، وظروف المخزون، وملف الوجهة.
ضع أسطوانة الفحص على خشبة المسرح، مضاءة بإضاءة خلفية بالأشعة تحت الحمراء في غرفة مظلمة، واسمح للأسماك بالتأقلم لمدة ثلاث دقائق بعد وضعها على المسرح. بعد ثلاث دقائق من التسارع في الظلام، سجل ثلاث دقائق و30 ثانية من الفيديو. في بداية التسجيل، أدخل قضيب الزجاج المتذبذب قطره 7.5 ملليمتر في عمود الماء، بعمق 5 سنتيمترات تقريبًا.
تجنب إحداث أي ضوضاء أو اهتزازات أثناء وضع قضيب الزجاج المهتز في الماء ، حيث يمكن للأسماك الشعور بالضوضاء والذبذبات الطفيفة. تأكد من إنهاء هذا الإجراء خلال 30 ثانية من بدء تسجيل الفيديو للتأكد من تسجيل أكثر من ثلاث دقائق من السلوك. تشغيل ملف دفعي بالنقر المزدوج فوق avs_creator.
الخفافيش لتحويل الفيديو AVI مضغوط إلى تنسيق قابل للقراءة لImageJ. يمكن تحميل الماكرو ببساطة عن طريق السحب والإفلات في قذيفة واجهة المستخدم الرسومية. هذا الماكرو تمكين مفاتيح التشغيل السريع معينة للتحليل التالي.
في دليل العمل، قم بإنشاء مجلد جديد ثم قم بتسمية Process_ImageJ. سيتم استخدام هذا المجلد تلقائياً لتخزين ملفات الإخراج من التحليل التالي. انقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف الفيديو AVS ليتم تحليلها وتحديد جبل سريع.
بعد تحميل الملف AVS كمحرك أقراص خارجي، افتح الملف AVI في ImageJ. لتعيين مقياس قياس المسافة ، حدد قطر غرفة المقايسة عن طريق رسم خط مستقيم عبر الغرفة باستخدام أداة تحديد الخط المستقيم ، ثم قم بتعيين المقياس بالنقر فوق تحليل ، تعيين وظيفة مقياس. بالنسبة لقضيتنا، نقوم بإدخال 9.4 سنتيمتر.
حدد مربع الراديو من العمومية من أجل توحيد مقياس عبر جميع تحليل الفيديو التالية. انسخ منطقة حجرة المقايسة باستخدام أداة التحديد البيضاوي، ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق ثم حدد نسخة مكررة. في هذا الوقت، حدد نطاق الإطارات التي يجب الاحتفاظ بها لمزيد من التحليل.
واضح خارج غرفة فحص وتحويل الصورة إلى صورة ثنائية عن طريق ضرب مفتاح التشغيل السريع سبعة على شريط الأرقام. بعد مسح الخلفية، ستتم مطالبتك بإضافة نقطة سوداء في المركز للإشارة إلى موضع قضيب الزجاج المهتز باستخدام أداة التحديد البيضاوي التي تم تعيينها بالفعل إلى الأسود مع وظيفة التعبئة. انقر فوق موافق وسيطالبك الماكرو للانتقال إلى ضبط الحد.
ضبط عتبة بحيث الأسماك هي قادرة على أن ينظر إليها في جميع أنحاء مقطع الفيديو بأكمله، ثم حدد تطبيق. تشغيل المقتفي المكونات في عن طريق ضرب مفتاح التشغيل السريع ثمانية على شريط الأرقام. تعيين الحد الأدنى لحجم البيكسل إلى 100 عند المطالبة.
هذه العملية سوف تولد المسافة بين قضيب الزجاج تهتز والأسماك لكل إطار لجميع ثلاث دقائق من الفيديو ثنائي. لحفظ ملف تعقب، اضغط على مفتاح التشغيل السريع تسعة على شريط الأرقام. هذا سوف تلقائيا تصدير كومة ثنائية من الصور من الفيديو بأكمله وملف XLS مع الإحداثيات وبيانات المسافة، في حال كان من الضروري إعادة تحليل.
سيؤدي هذا أيضًا إلى إغلاق كافة الملفات المقترنة بالفيديو الحالي. يمكن الآن أن الملفات التي تم إنشاؤها مزيد من التحليل اعتمادا على سؤال بحثي محدد. Acclimate خمسة الأسماك التجريبية لمدة أربعة أيام أو أكثر في كل غرفة من تصميم مخصص 10 لتر الاكريليك تسجيل الحوض مليئة المياه المكيفة.
يتم فصل كل غرفة على حدة مع لوحة الاكريليك السوداء. يجب تغطية كل خزان لمنع الأسماك من القفز إلى غرفة أخرى. تعيين جهاز ضبط الطاقة للبرمجة لتشغيل ضوء LED الأبيض تلقائيا لمدة 12 ساعة وخارجها لمدة 12 ساعة كل يوم خلال فترة التأقلم.
وهذا سوف entrain إيقاع circadian الأسماك إذا كانت الأسماك عرضة لentrainment. من أجل توفير ضوء أبيض أكثر انتشارا، ونحن نستخدم لوحة بيضاء مسطحة أكريليك مبهمة ذات البعد المماثل للدبابات 10 لتر كما الناشر لتمرير الضوء من خلال لكل خزان. خلال هذه الفترة، وتوفير مرة واحدة في اليوم تغذية مع الروبيان محلول ملحي الحية وتوفير تهيّم من خلال مرشح الإسفنج في كل حوض للماء.
لاحظ، ضمان يتم تغذية الأسماك في وقت ثابت. على سبيل المثال، مرة واحدة في اليوم في الصباح. في اليوم السابق ليوم الفحص ، ثلاثة أيام أو أكثر من التأقلم ، استبدل الماء في غرفة الفحص بالمياه الطازجة المكيفة.
تعيين تسجيل المعلمات في برنامج VirtualDub. سيتم تسجيل الفيديو في 15 إطارًا في الثانية في وقت التعرض الثابت. يتم ضغط الفيديو في الترميز X264VFW لتحقيق ضغط 700 مرات تقريبا.
في يوم التسجيل، يُطعم كل سمكة بالجمبري المحلول الحي. إزالة جميع مرشح الإسفنج والبدء في التسجيل. قم بتشغيل ضوء الأشعة تحت الحمراء في مرحلة التسجيل.
من خلال مراقبة الصورة الافتراضية المباشرة على الشاشة، وضبط موقف كل حوض للماء للتأكد من أنها تواجه كاميرا USB بشكل صحيح. ابدأ التسجيل على مدار 24 ساعة في الصباح. على سبيل المثال، وقت البدء هو 9 a.m.
ووقت الانتهاء هو 9 .m في اليوم التالي. ابدأ في التقاط الفيديو واضمن الموقع لتجنب الإزعاج.
أحياناً تحقق من تشغيل التسجيل. بعد تسجيل 24 ساعة، تأكد من حفظ الفيديو بشكل صحيح. نقل الفيديو إلى محطة عمل PC لتعقب سلوك الأسماك.
بعد نقل الفيديو إلى المجلد المناسب ، قم بسرعة بفحص جودة الفيديو للتأكد من أنه من نوعية جيدة. وهذا يشمل النظر في الإضاءة، والتحقق مما إذا كان هناك سمكة واحدة في كل قسم، وإذا كان هناك أي تحركات أجنبية قد تسبب سوء تتبع. من هنا، يتم استخدام برنامج SwisTrack المجاني لتتبع الحيوانات.
وميزة هذا البرنامج هو أن البرنامج يمكن تتبع الحيوانات متعددة في وقت واحد وطرح صورة خلفية باستخدام إطار التعسفية نحدد. مساوئ هي أن تتبع قد تقفز بين الساحات التي تحتوي على سمكة مختلفة. قد لا تكون صورة الخلفية كافية للإطارات اللاحقة ، وSwisTrack يعين عشوائيا تتبع معرف للأسماك الفردية ، وبالتالي فمن الضروري استرداد هوية الأسماك عن طريق رسم متوسط الموقف المادي لكل سمكة.
ومن أجل التغلب على هذه المسائل، تستخدم ثلاثة نهج. استخدام الأقنعة الثنائية، واحدة لتتبع الساحات المرقمة حتى، واحد لتتبع الساحات الفردية المرقمة. استخدام وين أتمتة لتحديث الصور الخلفية تلقائيا كل ثلاث دقائق واستخدام البرامج النصية بيرل لإعادة بناء الهاتيات السمك.
الخطوة الأولى من التحليل هو جعل أقنعة ثنائية لساحات غريبة وحتى. بعد التحقق من جودة الفيديو، اختر إطار ممثل في برنامج تحرير الفيديو واستخدمه لإنشاء قناعين ثنائيين، أحدهما حتى والأخرى لساحات الأرقام الفردية. الغرض من هذه الأقنعة الثنائية هو تجنب الأخطاء الخاطئة بين الساحات المجاورة.
بعد إجراء أقنعة ثنائية، افتح ملفات المعلمة SwisTrack التي تحدد مسارات الملفات والمعلمات لعملية التتبع. إعداد ملف معلمة واحد في كل من مجلدات الملفات الزوجية و الفردية لتعقب الفيديو. في هذا الملف، اكتب في المسار إلى مواقع الملفات ملفات الفيديو وقناع.
بعد إعداد ملفات المعلمة، افتح الملف التنفيذي لـ Win-automation الذي يقوم بإعادة تعيين الخلفية تلقائياً كل ثلاث دقائق. مع هذا الملف القابل للتنفيذ، SwisTrack سيتم تشغيل تلقائيا، ثم فتح ملف المعلمة في كل مجلد حتى أو الفردية في هذا البرنامج تتبع. تشغيل برنامج تتبع لتتبع حركة الأسماك.
ضمن أول 9000 إطار من التتبع، تأكد من أن الأسماك يتم تعقبها بشكل صحيح من خلال النظر إلى أقرب عنصر تتبع الجيران. بعد إنشاء التتبع بشكل صحيح، ارجع إلى علامة تبويب مكون طرح الخلفية التكيفية وضرب مفتاح التشغيل السريع R على لوحة المفاتيح لتشغيل التشغيل التلقائي لـ Win لطرح الخلفية التكيفية المستمرة. بعد حوالي خمس ساعات، يتم إنشاء ملفات نصية لكل سمكة، تحتوي على إحداثيات X و Y لكل إطار من الفيديو.
لمتابعة التحليل، قم بتخصيص ملفات البرنامج النصي Perl الثلاثة إلى المجلد الذي يتضمن المجلدات الزوجية و الفردية. من أجل تحويل الطول بالبكسل إلى سنتيمتر، من الضروري معرفة نسبة سنتيمتر إلى بكسل. اكتب هذه النسبة في الموقع المناسب لملف البرنامج النصي Perl المسمى 1.fillupGaps.pl.
تشغيل 1.fillupGaps. pl بيرل النصي باستخدام محاكي يونكس لنظام التشغيل Windows. أولاً، استخدم الأمر CD للانتقال إلى دليل العمل الحالي ثم اكتب بيرل 1.fillupGaps.
pl لتشغيل البرنامج النصي بيرل. سيتم استدعاء البرامج النصية الأخرى اثنين تلقائياً في ترتيب تسلسلي. هذه البرامج النصية الثلاثة تعيين كل ملف تتبع إلى كل قسم من الحوض، وبالتالي يمكن استخدامها لتحليل سلوك كل سمكة.
confer مع الملف النصي المسمى Summary_Sleep الذي تم إنشاؤه بعد تشغيل البرامج النصية للتحقق من أن عدد الإطارات التي تم إسقاطها من التحليل هو منخفض مقبول. يعتبر فقدان أقل من 15٪ من الإطارات مقبولة. نسخ ولصق تعقب البيانات في ملف جدول بيانات مع ماكرو داخلي.
سيقوم هذا الماكرو بإعادة هيكلة البيانات المحللة في عدة مستويات عملية خطوة، مثل متوسط مدة النوم ومجموع مسافة السباحة. من أجل وصمة عار خط السمك الجانبي، حل حل الأسهم DASPEI في المياه المكيفة لتركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر، ثم غمر السمك في الحل في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة لمدة 45 دقيقة. بعد 45 دقيقة، واستعادة الأسماك من حل DASPEI وتزج في الماء البارد المثلج مكيفة مع MES ثلاثة أضعاف اثنين.
مرة واحدة يتم تخدير الأسماك بعمق، جبل الأسماك في طبق بيتري ومراقبته تحت المجهر كفاءة. تأكد من اتخاذ سلسلة إحصائية لتشمل جميع خطط الأسماك في التركيز وتجميع كل شيء في صورة واحدة. لتحليل الصور، أضف مجلدًا جديدًا بعنوان Process_ImageJ وملف الماكرو إلى المجلد الذي يحتوي على الصور التي سيتم تحليلها.
افتح برنامج ImageJ ثم افتح الماكرو بسحب ملف الماكرو إلى ImageJ. تشغيل الماكرو بالنقر فوق وحدات الماكرو تشغيل الماكرو. إذا لم يتم فتح الصورة تلقائياً، انقر فوق الماكرو، ملف بيك اب.
ثم سوف الماكرو التقاط تلقائيا ملف صورة لتحليل. بالنسبة إلى القياس الكمي للعصبية، يُظهر تحديد المنطقة التي تهمها بالنقر فوق مضلع اثنين، ورسم المنطقة على الصورة. ثمانية، خمسة لتكرار المنطقة ذات الأهمية.
استخدام أداة الطلاء لإزالة أو إضافة أي نقطة إضافية أو مفقودة من الصورة السابقة ثم ثمانية، ستة. بمجرد أن تظهر نوافذ جديدة ثمانية أو ستة أو نافذتين جديدتين. نافذة تُظهر مخططًا من النقاط ذات الأرقام العصبية والنافذة مع جدول مع إجمالي الورم العصبي الكمي.
ضرب سبعة لحفظ كلا الملفين. بمجرد النقر فوق موافق، يتم تخزين هذه الملفات وسيتم فتح ملف صورة جديد لمزيد من التحليل. دمج عدد اصبو بواسطة تشغيل الماكرو.
النتائج التالية هي نتائج تمثيلية لما يمكن توقعه لكل من التشكلات من الأسماك في ظروف خاضعة للرقابة. هذه الأرقام الأربعة تظهر النتائج التمثيلية من مقايسات سلوك جذب الاهتزاز. A و B هي أعلى وجهات النظر من مسار السباحة من A، والأسماك السطحية، وب سمكة كهفية.
الخطوط الحمراء هي آثار الإحداثيات التي تم إنشاؤها بواسطة تتبع ImageJ عبر ثلاث دقائق من التسجيل. C و D إظهار مقارنة النتائج من C، سمكة سطحية، و D، كهوف، المستخرجة من ماكرو جدول البيانات من ملفات TXT. المحور Y هو عدد مرات حساب الأسماك اقترب قضيب تهتز.
كل نقطة تمثل ملاحظة تجريبية واحدة أثناء الفحص السلوكي للأسماك الواحدة. لاحظ أن الأسماك السطحية لا تظهر زيادة في النهج في أي تردد، في حين أن أسماك الكهوف تظهر الحد الأقصى للجذب حوالي 35 إلى 40 هيرتز. هذان الرقمان إظهار نتائج تمثيلية من عمليات فحص سلوك السكون المستخرجة من قبل وحدات ماكرو جدول البيانات من ملفات TXT.
أ و ب يوضحان اثنين من القياسات التي يتم تلخيصها تلقائياً بواسطة ملف الماكرو. يظهر الشكل A مسافة السباحة في النهار والليل للأسماك السطحية وسمك الكهوف، في حين يظهر B مدة النوم لكلا المورف. في هذه الحالة، أظهرت أسماك الكهف فرط النشاط والنوم أقل بالمقارنة مع الأسماك السطحية.
تظهر هذه الأرقام نتائج تحليل الصور DASPEI المستخرجة من ماكرو جدول البيانات من ملفات TXT. A و B تثبت العلاقة بين عدد اعصاب مقابل سلوك جذب الاهتزاز وحجم العصاب مقابل السلوك في سمك الكهف، والأسماك السطحية، وذرية F1. كل نقطة تمثل كل سمكة.
ملاحظة، يرتبط الرقم العصبي بشكل إيجابي مع سلوك جذب الاهتزاز، مما يشير إلى أن الورم العصبي قد ينظم هذا السلوك. حجم العصبية يدعم أيضا هذا الاستنتاج. C و D هي صور مثال من داسبي لطخة العصبية من C، سمكة سطحية، وD، سمكة كهفية.
كل نقطة فلورية في الصور هي واحدة من الناحية العصبية، والتي اتخذت DASPEI. لاحظ، وفرة أكبر بشكل ملحوظ من الاعصاب على سمك الكهف. أظهرنا سلسلة من تحليلات السلوك لنشاط السباحة القائم على الخط الجانبي والنوم.
كما يمكن تكييف نظام تتبع الحيوانات مع السلوكيات الأخرى، مثل السلوكيات النمطية المتكررة، والتفاعلات الاجتماعية، والجانب السلوكي.
