Cavefish поднимает как фантастическое животное фреска, чтобы понять эволюцию и биомедицинских процессов. В настоящее время мы проводим биомедицинские исследования, используя эти черты как параллель человеческих симптомов. Здесь мы покажем батарею анализа поведения и систему анализа, которая может быть использована как для эволюционных, так и для биомедицинских исследований.
Для анализа вибрации привлекает и поведение, вибрирующий стеклянный стержень вставляется в стеклянную миску, содержащую одну рыбу в темноте. Рыба акклиматизируются за четыре дня до анализа в кондиционированной воде с 12, 12 светлым, темным циклом. За день до дня анализа после трех дней акклиматизации замените воду в камере анализа свежей кондиционированной водой.
В день анализа, рыбы лишены пищи до тех пор, пока анализ завершен, потому что прекращение изменит их реакцию на вибрации. Подготовь вибрационный аппарат, настраивая до 40 Герц. Установите надлежащие параметры записи, условия запаса и файл назначения.
Поместите цилиндр анализа на сцену записи, освещенный инфракрасной подсветкой в темной комнате, и позвольте рыбе акклиматизироваться в течение трех минут после того, как ее поместили на сцену. После трехминутной акклиматизации в темноте замыкаем три минуты и 30 секунд видео. В начале записи вставьте в вибрирующий стеклянный стержень диаметром 7,5 миллиметра в колонку воды глубиной около 5 сантиметров.
Избегайте шума или вибраций при позиционировании вибрирующего стеклянного стержня в воде, так как рыба может чувствовать незначительные шумы и вибрации. Убедитесь в том, чтобы закончить эту процедуру в течение 30 секунд после начала видеозаписи, чтобы убедиться, что более трех минут поведения записывается. Вы запустите пакетный файл, дважды avs_creator.
летучая мышь для преобразования сжатого видео AVI в читаемый формат для ImageJ. Макрос может быть загружен просто перетащить и падение в графический пользовательский интерфейс оболочки. Этот макрос позволит некоторым hotkeys для следующего анализа.
В рабочем каталоге создайте новую папку и назовите ее Process_ImageJ. Эта папка будет автоматически использоваться для хранения выходных файлов из следующего анализа. Нажмите правой кнопкой мыши на видео файл AVS для анализа и выбора быстрого монтажа.
После установки файла AVS в качестве внешнего диска откройте файл AVI в ImageJ. Чтобы установить шкалу измерения расстояния, выберите диаметр камеры анализа, нарисовав прямую линию по камере с помощью инструмента выбора прямой линии, а затем установите шкалу, нажав на анализ, установите функцию масштаба. Для нашего случая, мы вводим 9,4 сантиметров.
Проверьте радиоприемную глобальную коробку, чтобы стандартизировать масштаб во всех следующих видео-анализа. Скопируйте область камеры анализа с помощью инструмента овального отбора, а затем нажмите правой кнопкой мыши и выберите дубликат изображения. На данный момент укажите диапазон кадров для дальнейшего анализа.
Очистить вне камеры анализа и преобразовать изображение в двоичное изображение, нажав hotkey семь на номер бар. После того, как фон очищается, вам будет предложено добавить черную точку в центре, чтобы указать положение вибрирующего стеклянного стержня с помощью инструмента овального отбора, уже установленного в черный цвет с функцией заполнения. Нажмите OK и макрос подскажет вам перейти к регулировке порога.
Отрегулируйте порог так, чтобы рыбу можно было увидеть на протяжении всего видеоклипа, а затем выберите применить. Вы запустите плагин Tracker, нажав hotkey восемь на номер бар. Установите минимальный размер пикселя до 100, когда это будет предложено.
Этот процесс будет генерировать расстояние между вибрирующим стеклянным стержнем и рыбой на кадр в течение всех трех минут двоичного видео. Чтобы сохранить файл трекера, хит hotkey девять на номер бар. Это позволит автоматически экспортировать двоичную стопку изображений всего видео и файл XLS с координатами и данными расстояния, в случае необходимости повторного анализа.
Это также закроет все файлы, связанные с текущим видео. Созданные файлы теперь могут быть дополнительно проанализированы в зависимости от конкретного исследовательского вопроса. Акклиматизировать пять экспериментальных рыб в течение четырех дней или более в каждой камере пользовательского дизайна 10 литров акриловой записи аквариума заполнены с кондиционированной водой.
Каждая отдельная камера отделена черной акриловой доской. Каждый бак должен быть покрыт, чтобы предотвратить рыбу от прыжков в другую камеру. Установите программируемый таймер питания, чтобы автоматически включить белый светодиодный свет в течение 12 часов и выключается в течение 12 часов каждый день в период акклиматизации.
Это будет венчать циркадный ритм рыбы, если рыба восприимчива к поглощению. Для того, чтобы обеспечить более рассеянный белый свет, мы используем плоскую белую непрозрачную акриловую доску аналогичного размера 10-литровому баку в качестве диффузора, чтобы пройти свет через для каждого танка. В течение этого периода, обеспечить один раз в день кормления с живыми креветками рассола и обеспечить аэрацию через губку фильтр в каждом аквариуме.
Обратите внимание, убедитесь, что рыба подается в последовательное время. Например, один раз в день по утрам. За день до дня анализа, за три дня или более акклиматизации, заменить воду в камере анализа свежей кондиционированной водой.
Установите параметры записи в программном обеспечении VirtualDub. Видео будет записано в 15 кадрах в секунду в фиксированное время экспозиции. Видео сжимается в коде X264VFW для достижения примерно 700 раз сжатия.
В день записи кормите каждую рыбу живыми рассолами. Удалите весь фильтр губки и начните запись. Включите инфракрасный свет на этапе записи.
Наблюдая VirtualDub живое изображение на экране, настроить положение каждого аквариума, чтобы убедиться, что они сталкиваются с камерой USB должным образом. Начните 24-часовую запись утром. Например, время начала 9 .m.
и время окончания 9 утра .m следующий день. Начните захватывать видео и обезопасить место, чтобы избежать помех.
Иногда проверяйте, работает ли запись. После 24-часовой записи убедитесь, что видео сохранено правильно. Перенесите видео на рабочую станцию ПК, чтобы отслеживать поведение рыбы.
После передачи видео в соответствующую папку, быстро сделать проверку качества видео, чтобы убедиться, что он хорошего качества. Это включает в себя глядя на освещение, проверка, если есть одна рыба в каждом разделе, и если Есть какие-либо иностранные движения, которые могут вызвать неправильное движение. Отсюда, freeware SwisTrack используется для отслеживания животных.
Преимущество этого программного обеспечения заключается в том, что программное обеспечение может отслеживать несколько животных одновременно и вычитать фоновое изображение с помощью произвольного кадра мы определяем. Недостатки в том, что отслеживание может прыгать между аренами, содержащими различные рыбы. Фоновое изображение может быть недостаточно для более поздних кадров, и SwisTrack случайным образом присваивает идентификатор отслеживания отдельным рыбам, поэтому необходимо восстановить идентификатор рыбы, нарисовав среднее физическое положение каждой рыбы.
Для преодоления этих проблем используются три подхода. Использование бинарных масок, один для отслеживания четных арен, и один для отслеживания нечетных арен. Использование Win-автоматизации для автоматического обновления фоновых изображений каждые три минуты и использование скриптов Perl для реконструкции рыбных свия.
Первый шаг анализа заключается в том, чтобы сделать бинарные маски для нечетных и четных арен. Проверив качество видео, выберите репрезентативную рамку в программном обеспечении для редактирования видео и используйте ее для создания двух бинарных масок, одна для четных и одна для нечетных арен. Цель этих бинарных масок состоит в том, чтобы избежать неправильного зрения между смежными аренами.
После создания бинарных масок откройте файлы параметра SwisTrack, определяющие пути и параметры файла для процесса отслеживания. Подготовьте один параметр файла в каждой из четных и нечетных папок файлов для отслеживания видео. В этом файле ввеми на путь к местоположению файла видео и файлы масок.
После подготовки файлов параметров откройте файл Win-automation, который автоматически сбрасывает фон каждые три минуты. С помощью этого выполняемого файла SwisTrack будет работать автоматически, а затем откроет файл параметров в каждой четной или нечетной папке в этом программном обеспечении для отслеживания. Запустите программное обеспечение для отслеживания, чтобы отслеживать движение рыбы.
В течение первых 9000 кадров отслеживания убедитесь, что рыба надлежащим образом отслеживается, глядя на ближайший сосед отслеживания компонента. После правильного создания отслеживания, вернуться к адаптивному фону вычитания компонента вкладке и ударил hotkey R на клавиатуре для запуска Win-автоматизации для непрерывного адаптивного фонового вычитания. Примерно через пять часов для каждой рыбы генерируются текстовые файлы, содержащие координаты X и Y для каждого кадра видео.
Чтобы продолжить анализ, выделите три файла сценария Perl в папку, которая включает в себя как четные, так и нечетные папки. Для того, чтобы преобразовать длину в пиксели в сантиметры, необходимо знать отношение сантиметра к пикселю. Ввемите это соотношение в соответствующем месте файла скрипта Perl под названием 1.fillupGaps.pl.
Выполнить 1.fillupGaps. pl Perl скрипт с помощью эмулятора Unix для Windows. Во-первых, используйте команду CD, чтобы перейти к текущему рабочему каталогу, а затем ввените Perl 1.fillupGaps.
pl для запуска сценария Perl. Два других скрипта будут автоматически называться в последовательном порядке. Эти три скрипта назначают каждый файл отслеживания в каждом разделе аквариума, и, таким образом, могут быть использованы для анализа поведения каждой рыбы.
Совещаться с текстовым файлом под названием Summary_Sleep который генерируется после запуска скриптов, чтобы дважды проверить, что количество кадров, удаленных из анализа, приемлемо низкое. Отсутствует менее 15% кадров считается приемлемым. Копирование и вставка данных отслеживания в файл электронной таблицы с помощью домашнего макроса.
Этот макрос будет реструктурировать проанализированные данные на несколько уровней процесса шага, таких как средняя продолжительность сна и сумма расстояния плавания. Для того, чтобы запятнать рыбую боковой линии, растворить раствор бульона DASPEI в кондиционированной воде для окончательной концентрации пять микрограмм на миллилитр, а затем погрузить рыбу в раствор при комнатной температуре в темной среде в течение 45 минут. Через 45 минут, восстановить рыбу из раствора DASPEI и погрузить его в ледяной кондиционированной воды с МЭС тройной два.
После того, как рыба глубоко анестезируется, смонтировать рыбу в чашке Петри и наблюдать за ней под эффективным микроскопом. Убедитесь в том, чтобы взять статистику серии включить все планы рыбы в центре внимания и собрать все в одной картине. Для анализа изображений добавьте новую папку под названием Process_ImageJ и макроф файл в папку, содержащую изображения, которые будут проанализированы.
Открытое программное обеспечение ImageJ, а затем открыть макро, перетащив макроф файл на ImageJ. Вы запустите макрос, нажав макросы, запустите макрос. Если картинка не открывается автоматически, нажмите макрос, файл пикап.
Макро автоматически подхвет файл изображения для анализа. Для нейромастовой количественной оценки показана область интереса, нажав на полигон два, и нарисуйте область на картинке. Восемь, пять дублировать области интересов.
Используйте инструмент краски, чтобы удалить или добавить любую точку, которая является дополнительной или отсутствует в предыдущем изображении, а затем восемь, шесть. Как только вам восемь, шесть, появятся два новых окна. Окно, показывающее схему пронумерованные точки нейромаста и окно с таблицей с общей нейромастовой количественно.
Хит семь, чтобы сохранить оба файла. Как только вы нажмете OK, эти файлы хранятся и новый файл изображения откроется для дальнейшего анализа. Консолидируете количество нейромастов, запуская макрос.
Следующие результаты являются репрезентативными результатами того, что можно ожидать для обоих морфов рыбы в контролируемых условиях. Эти четыре цифры показывают репрезентативные результаты анализа поведения притяжения вибрации. A и B - это виды на плавательный путь А, поверхностной рыбы и пещерной рыбы B.
Красные линии являются следами координат, генерируемых отслеживанием ImageJ в течение трех минут записи. C и D показывают сравнение результатов C, поверхностной рыбы и D, пещерной рыбы, извлеченной макросом электронной таблицы из файлов TXT. Y-ось — это подсчитанное количество раз, когда рыба приближалась к вибрирующему стержням.
Каждая точка представляет собой одно экспериментальное наблюдение во время поведенческого анализа одной рыбы. Обратите внимание, что поверхностные рыбы не показывают увеличения подходов на любой частоте, в то время как пещерные рыбы показывают максимальную привлекательность около 35 до 40 Герц. Эти две цифры показывают репрезентативные результаты анализа поведения сна, извлеченные макросами электронной таблицы из файлов TXT.
A и B демонстрируют две метрики, автоматически обобщенные макрофаймом. Рисунок А показывает расстояние плавания в дневное и ночное время для поверхностных рыб и пещерных рыб, в то время как B показывает продолжительность сна для обоих морфов. В этом случае, пещерные рыбы показали гиперактивность и меньше сна по сравнению с поверхностными рыбами.
Эти цифры показывают результаты анализа изображений DASPEI, извлеченного макросом электронной таблицы из файлов TXT. A и B демонстрируют связь между числом нейромастов и поведением притяжения вибрации и размером нейромаста по сравнению с поведением у пещерных рыб, поверхностных рыб и потомков F1. Каждая точка представляет каждую рыбу.
Обратите внимание, что число нейромастов положительно коррелирует с поведением притяжения вибрации, предполагая, что нейромаст может регулировать такое поведение. Размер нейромаста также поддерживает этот вывод. C и D являются примером изображения DASPEI окрашенных нейромаста C, поверхностная рыба, и D, пещерная рыба.
Каждая флуоресцентная точка на снимках является одной нейромастой, которая заняла DASPEI. Отметим, заметно большее обилие нейромаст на пещерных рыб. Мы показали серию анализов поведения для боковой линии на основе поведения плавания деятельности и сна.
Система слежения за животными также может быть адаптирована к другим поведениям, таким как стереотипное повторяющееся поведение, социальные взаимодействия и поведенческая боковость.
