Cavefish wird als fantastisches Tiergemälde aufgezogen, um Evolution und biomedizinische Prozesse zu verstehen. Wir führen jetzt biomedizinische Untersuchungen durch, indem wir diese Eigenschaft als Parallele zu menschlichen Symptomen verwenden. Hier zeigen wir die Batterie des Verhaltens-Assays und des Analysesystems, das sowohl für evolutionäre als auch für biomedizinische Studien verwendet werden kann.
Um Vibrationen anzulocken und zu verhalten, wird eine vibrierende Glasstange in eine Glasschüssel mit einem Fisch im Dunkeln eingeführt. Fische werden vier Tage vor dem Test in konditioniertem Wasser mit einem 12, 12 hellen, dunklen Zyklus akklimatisiert. Am Tag vor dem Tag des Testes nach drei Tagen der Akklimatisierung, ersetzen Sie Wasser in der Assaykammer mit frischem konditioniertem Wasser.
Am Tag des Testes werden den Fischen bis nach Abschluss des Assays Nahrung vorenthalten, da die Einstellung ihre Reaktion auf Vibrationen verändern wird. Bereiten Sie Schwingungs-Emitting-Geräte vor, indem Sie auf 40 Hertz abstimmen. Legen Sie die richtigen Aufzeichnungsparameter, Bestandsbedingungen und Zieldateien fest.
Stellen Sie den Assayzylinder auf die Aufnahmebühne, beleuchtet mit Infrarot-Hintergrundbeleuchtung in einem dunklen Raum, und lassen Sie Fische drei Minuten lang akklimatisieren, nachdem sie auf die Bühne gestellt wurden. Nach der dreiminütigen Akklimatisierung im Dunkeln drei Minuten und 30 Sekunden Video aufnehmen. Legen Sie zu Beginn der Aufnahme den vibrierenden Glasstab mit einem Durchmesser von 7,5 Millimetern in die etwa 5 Zentimeter tiefe Wassersäule ein.
Vermeiden Sie Geräusche oder Vibrationen, während Sie die vibrierende Glasstange im Wasser positionieren, da Fische kleinere Geräusche und Vibrationen erkennen können. Stellen Sie sicher, dass Sie dieses Verfahren innerhalb von 30 Sekunden nach dem Start der Videoaufzeichnung abschließen, um sicherzustellen, dass mehr als drei Minuten Verhalten aufgezeichnet werden. Führen Sie die Batchdatei aus, indem Sie auf avs_creator doppelklicken.
, um das komprimierte AVI-Video in ein lesbares Format für ImageJ zu konvertieren. Das Makro kann einfach per Drag & Drop in eine grafische Benutzeroberflächen-Shell geladen werden. Dieses Makro aktiviert bestimmte Hotkeys für die folgende Analyse.
Erstellen Sie im Arbeitsverzeichnis einen neuen Ordner, und benennen Sie ihn Process_ImageJ. Dieser Ordner wird automatisch verwendet, um Ausgabedateien aus der folgenden Analyse zu speichern. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die zu analysierende AVS-Videodatei und wählen Sie die schnelle Bereitstellung aus.
Nachdem die AVS-Datei als externes Laufwerk gemountet wurde, öffnen Sie die AVI-Datei in ImageJ. Um den Maßstab der Entfernungsmessung festzulegen, wählen Sie den Durchmesser der Assaykammer aus, indem Sie mit dem Auswahlwerkzeug für gerade Linien eine gerade Linie über die Kammer zeichnen, und legen Sie dann den Maßstab fest, indem Sie auf Analysieren, Skalierungsfunktion festlegen. Für unseren Fall geben wir 9,4 Zentimeter ein.
Überprüfen Sie die Radiobox global, um die Skalierung für alle folgenden Videoanalysen zu standardisieren. Kopieren Sie den Assay-Kammerbereich mit dem ovalen Auswahlwerkzeug, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie das Bildduplikat aus. Geben Sie zu diesem Zeitpunkt den Rahmenbereich an, der für die weitere Analyse beibehalten werden soll.
Löschen Sie außerhalb der Assay-Kammer und konvertieren Sie das Bild in ein binäres Bild, indem Sie die Hotkey-Sieben auf der Zahlenleiste drücken. Nachdem sich der Hintergrund gecleart hat, werden Sie aufgefordert, einen schwarzen Punkt in der Mitte hinzuzufügen, um die Position der vibrierenden Glasstange anzugeben, indem Sie das ovale Auswahlwerkzeug verwenden, das bereits mit der Füllfunktion auf Schwarz eingestellt ist. Klicken Sie auf OK, und das Makro fordert Sie auf, zur Schwellenwertanpassung überzugehen.
Passen Sie den Schwellenwert so an, dass der Fisch während des gesamten Videoclips angezeigt werden kann, und wählen Sie dann Anwenden aus. Führen Sie das Tracker-Plug-In aus, indem Sie den Hotkey Acht auf der Zahlenleiste drücken. Legen Sie die minimale Pixelgröße auf 100 fest, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
Dieser Prozess erzeugt den Abstand zwischen der vibrierenden Glasstange und den Fischen pro Rahmen für alle drei Minuten des binären Videos. Um die Tracker-Datei zu speichern, drücken Sie den Hotkey neun auf der Zahlenleiste. Dadurch wird automatisch ein binärer Stapel von Bildern des gesamten Videos und eine XLS-Datei mit Koordinaten und Entfernungsdaten exportiert, falls es notwendig ist, neu zu analysieren.
Dadurch werden auch alle Dateien geschlossen, die dem aktuellen Video zugeordnet sind. Die generierten Dateien können nun je nach Forschungsfrage weiter analysiert werden. Akklimatisieren Sie fünf Versuchsfische für vier Tage oder mehr in jeder Kammer eines kundenspezifischen 10-Liter-Acryl-Aufnahmeaquariums, das mit konditioniertem Wasser gefüllt ist.
Jede einzelne Kammer ist mit schwarzer Acrylplatte getrennt. Jeder Tank muss abgedeckt werden, um zu verhindern, dass Fische in eine andere Kammer springen. Stellen Sie den programmierbaren Power-Timer so ein, dass weißes LED-Licht während der Akklimatisierungszeit 12 Stunden lang automatisch für 12 Stunden ausgeschaltet wird.
Dies wird den zirkadianen Rhythmus der Fische einwirken, wenn der Fisch anfällig für Entrainment ist. Um ein diffuseres weißes Licht zu bieten, verwenden wir eine flache weiße, opake Acrylplatte von ähnlicher Dimension wie der 10-Liter-Tank als Diffusor, um Licht für jeden Tank zu passieren. Während dieser Zeit einmal täglich fütterung mit lebenden Solegarnelen und belüftung durch Schwammfilter in jedem Aquarium.
Beachten Sie, dass Fische zu konsistenter Zeit gefüttert werden. Zum Beispiel einmal täglich am Morgen. Am Tag vor dem Tag des Testes, drei Tage oder mehr der Akklimatisierung, ersetzen Wasser in der Assaykammer mit frischem konditioniertem Wasser.
Legen Sie die Aufzeichnung der Parameter in der VirtualDub-Software fest. Das Video wird in 15 Bildern pro Sekunde in der festen Belichtungszeit aufgenommen. Das Video wird im X264VFW-Codec komprimiert, um eine ca. 700-fache Komprimierung zu erreichen.
Füttern Sie am Tag der Aufnahme jeden Fisch mit lebenden Solegarnelen. Entfernen Sie alle Schwammfilter und starten Sie die Aufnahme. Schalten Sie das Infrarotlicht in der Aufnahmephase ein.
Indem Sie VirtualDub Live-Bild auf dem Bildschirm beobachten, passen Sie die Position jedes Aquariums an, um sicherzustellen, dass sie der USB-Kamera richtig gegenüberstehen. Beginnen Sie die 24-Stunden-Aufnahme am Morgen. Die Startzeit beträgt z. B. 9 a.m.
und Zielzeit ist 9 a.m am nächsten Tag. Starten Sie die Aufnahme des Videos und sichern Sie den Standort, um Störungen zu vermeiden.
Überprüfen Sie gelegentlich, ob die Aufzeichnung ausgeführt wird. Stellen Sie nach der 24-Stunden-Aufnahme sicher, dass das Video korrekt gespeichert wurde. Übertragen Sie das Video auf die PC-Workstation, um das Verhalten des Fisches zu verfolgen.
Nachdem Sie das Video in den entsprechenden Ordner übertragen haben, führen Sie schnell eine Qualitätsprüfung des Videos durch, um sicherzustellen, dass es von guter Qualität ist. Dazu gehört, die Beleuchtung zu betrachten, zu überprüfen, ob es einen Fisch in jedem Abschnitt gibt, und ob es irgendwelche fremden Bewegungen gibt, die fehltracking verursachen können. Von hier aus wird die Freeware SwisTrack für die Tierverfolgung verwendet.
Der Vorteil dieser Software ist, dass die Software mehrere Tiere auf einmal verfolgen und Hintergrundbild subtrahieren kann, indem sie einen beliebigen Rahmen verwendet, den wir identifizieren. Die Nachteile sind, dass Tracking zwischen Arenen mit einem anderen Fisch springen kann. Das Hintergrundbild ist möglicherweise nicht ausreichend für die späteren Frames, und SwisTrack weist einzelnen Fischen nach dem Zufallsprinzip tracking ID zu, daher ist es notwendig, die Fisch-ID durch Plotten der durchschnittlichen physischen Position jedes Fisches wiederherzustellen.
Um diese Probleme zu überwinden, werden drei Ansätze verwendet. Die Verwendung von binären Masken, eine für die Verfolgung von geraden Arenen, und eine für die Verfolgung von ungeraden Zahlen Arenen. Die Verwendung von Win-Automation, um Hintergrundbilder automatisch alle drei Minuten zu aktualisieren, und die Verwendung von Perl-Skripten, um die Fisch-IDs zu rekonstruieren.
Der erste Schritt der Analyse ist es, die binären Masken für ungerade und sogar Arenen zu machen. Nach der Überprüfung der Videoqualität, wählen Sie einen repräsentativen Rahmen in einer Videobearbeitungssoftware und verwenden Sie es, um zwei binäre Masken zu erstellen, eine für gerade und eine für ungerade Zahlen Arenen. Der Zweck dieser binären Masken ist es, Fehlverfolgungen zwischen benachbarten Arenen zu vermeiden.
Öffnen Sie nach dem Erstellen von Binärmasken die SwisTrack-Parameterdateien, die die Dateipfade und Parameter für den Nachverfolgungsprozess bestimmen. Bereiten Sie eine Parameterdatei in jedem der geraden und ungeraden Dateiordner für die Videoverfolgung vor. Geben Sie in dieser Datei den Pfad zu den Dateispeicherorten der Video- und Maskendateien ein.
Öffnen Sie nach dem Vorbereiten der Parameterdateien die ausführbare Win-Automation-Datei, die den Hintergrund automatisch alle drei Minuten zurücksetzt. Mit dieser ausführbaren Datei wird SwisTrack automatisch ausgeführt und öffnet dann die Parameterdatei in jedem geraden oder ungeraden Ordner in dieser Tracking-Software. Führen Sie die Tracking-Software aus, um die Bewegung von Fischen zu verfolgen.
Stellen Sie in den ersten 9 000 Tracking-Frames sicher, dass die Fische ordnungsgemäß verfolgt werden, indem Sie sich die nächste Nachbar-Tracking-Komponente ansehen. Kehren Sie nach dem ordnungsgemäßen Einrichten der Nachverfolgung zur Registerkarte adaptive Hintergrundsubtraktionskomponente zurück, und drücken Sie den Hotkey R auf der Tastatur, um Win-Automation für eine kontinuierliche adaptive Hintergrundsubtraktion auszuführen. Nach etwa fünf Stunden werden für jeden Fisch Textdateien generiert, die X- und Y-Koordinaten für jeden Frame des Videos enthalten.
Um die Analyse fortzusetzen, weisen Sie die drei Perl-Skriptdateien dem Ordner zu, der sowohl gerade als auch ungerade Ordner enthält. Um die Länge in Pixel in Zentimeter umzuwandeln, ist es notwendig, das Zentimeter-Pixel-Verhältnis zu kennen. Geben Sie dieses Verhältnis an der entsprechenden Position der Perl-Skriptdatei mit dem Namen 1.fillupGaps.pl ein.
Führen Sie 1.fillupGaps aus. pl Perl-Skript mit einem Unix-Emulator für Windows. Verwenden Sie zunächst den Befehl CD, um zum aktuellen Arbeitsverzeichnis zu wechseln, und geben Sie dann Perl 1.fillupGaps ein.
pl, um das Perl-Skript auszuführen. Die anderen beiden Skripte werden automatisch in sequenzieller Reihenfolge aufgerufen. Diese drei Skripte weisen jedem Abschnitt des Aquariums jede Tracking-Datei zu und können daher verwendet werden, um das Verhalten jedes Fisches zu analysieren.
Besprechen Sie die Textdatei mit dem Namen Summary_Sleep, die nach dem Ausführen der Skripts generiert wird, um zu überprüfen, ob die Anzahl der aus der Analyse gelöschten Frames akzeptabel niedrig ist. Das Fehlen von weniger als 15 % der Frames gilt als akzeptabel. Kopieren und einfügen Sie Tracking-Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei mit einem internen Makro.
Dieses Makro wird die analysierten Daten in mehrere Schrittprozessebenen umstrukturieren, z. B. durchschnittliche Schlafdauer und Summe der Schwimmdistanz. Um die seitliche Linie der Fische zu färben, lösen Sie die DASPEI-Stammlösung in konditioniertem Wasser für eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter auf und tauchen Sie den Fisch dann 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in die Lösung ein. Nach 45 Minuten die Fische aus der DASPEI-Lösung bergen und mit MES Triple Two in eiskaltes Konditionalwasser eintauchen.
Sobald der Fisch tief anästhesisiert ist, montieren Sie den Fisch in einer Petrischale und beobachten Sie ihn unter effizientem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Statistikserie erstellen, um alle Pläne der Fische in den Fokus zu nehmen und alles in einem einzigen Bild zusammenzustellen. Fügen Sie für die Bildanalyse einen neuen Ordner mit dem Titel Process_ImageJ und die Makrodatei zu dem Ordner hinzu, der die zu analysierenden Bilder enthält.
Öffnen Sie die ImageJ-Software, und öffnen Sie dann das Makro, indem Sie die Makrodatei nach ImageJ ziehen. Führen Sie das Makro aus, indem Sie auf Makros klicken, führen Sie das Makro aus. Wenn das Bild nicht automatisch geöffnet wird, klicken Sie auf Makro, Dateiabholung.
Das Makro nimmt dann automatisch eine Bilddatei zur Analyse auf. Für Neuromast Quantifizierung zeigt die Region von Interesse durch Klicken auf Polygon zwei, und zeichnen Sie den Bereich auf dem Bild. Acht, fünf, um eine Region von Interesse zu duplizieren.
Verwenden Sie das Malwerkzeug, um einen Punkt zu entfernen oder hinzuzufügen, der im vorherigen Bild extra oder fehlend ist, und dann acht, sechs. Sobald Sie acht, sechs, zwei neue Fenster erscheinen. Ein Fenster mit einem Schema nummerierter Neuromastpunkte und ein Fenster mit einem Tisch mit gesamt erzählbarem Neuromast.
Klicken Sie auf sieben, um beide Dateien zu speichern. Sobald Sie auf OK klicken, werden diese Dateien gespeichert und eine neue Bilddatei wird zur weiteren Analyse geöffnet. Konsolidieren Sie die Anzahl der Neuromasten, indem Sie Makro ausführen.
Die folgenden Ergebnisse sind repräsentative Ergebnisse dessen, was für beide Morphs von Fischen unter kontrollierten Bedingungen zu erwarten ist. Diese vier Abbildungen zeigen repräsentative Ergebnisse von Schwingungs-Anziehungsverhaltens-Assays. A und B sind Top-Blick auf den Schwimmweg von A, ein Oberflächenfisch, und B ein Höhlenfisch.
Rote Linien sind die Spuren der Koordinaten, die durch die ImageJ-Verfolgung über drei Minuten der Aufzeichnung generiert werden. C und D zeigen einen Vergleich der Ergebnisse von C, einem Oberflächenfisch, und D, einem Höhlenfisch, der vom Tabellenmakro aus den TXT-Dateien extrahiert wird. Die Y-Achse ist die gezählte Anzahl, mit der sich der Fisch der vibrierenden Stange nähert.
Jeder Punkt stellt eine experimentelle Beobachtung während des Verhaltens-Assays eines Fisches dar. Beachten Sie, dass Oberflächenfische keine Zunahme der Annäherungen in irgendeiner Häufigkeit zeigen, während Höhlenfische eine maximale Anziehungskraft um 35 bis 40 Hertz aufweisen. Diese beiden Abbildungen zeigen repräsentative Ergebnisse von Schlafverhaltenstests, die von den Tabellenkalkulationsmakros aus den TXT-Dateien extrahiert wurden.
A und B zeigen zwei der Metriken, die automatisch durch die Makrodatei zusammengefasst werden. Abbildung A zeigt die Schwimmdistanz bei Oberflächenfischen und Höhlenfischen, während B die Schlafdauer für beide Morphs anzeigt. In diesem Fall zeigten Höhlenfische Hyperaktivität und weniger Schlaf im Vergleich zu Oberflächenfischen.
Diese Zahlen zeigen die Ergebnisse der DASPEI-Bildanalyse, die vom Tabellenmakro aus den TXT-Dateien extrahiert wurde. A und B zeigen die Beziehung zwischen Neuromastzahl und Vibrationsanziehungsverhalten und Neuromastgröße im Vergleich zum Verhalten bei Höhlenfischen, Oberflächenfischen und F1-Nachkommen. Jeder Punkt stellt jeden Fisch dar.
Beachten Sie, dass die Neuromastzahl positiv mit dem Vibrationsanziehungsverhalten korreliert, was darauf hindeutet, dass Neuromast dieses Verhalten regulieren kann. Neuromastgröße unterstützt auch diese Schlussfolgerung. C und D sind Beispielbilder von DASPEI gebeizten Neuromast von C, einem Oberflächenfisch, und D, einem Höhlenfisch.
Jeder fluoreszierende Punkt in den Bildern ist ein Neuromast, der DASPEI aufgenommen hat. Beachten Sie, die deutlich größere Fülle von Neuromasten auf Höhlenfischen. Wir zeigten eine Reihe von Verhaltensanalysen für seitliche linienbasierte Verhaltensschwimmaktivität und Schlaf.
Das Tierverfolgungssystem kann auch an andere Verhaltensweisen angepasst werden, z. B. stereotype repetitive Verhaltensweisen, soziale Interaktionen und Verhaltenslateralität.
