Cavefish는 진화와 생물 의학 과정을 이해하는 환상적인 동물 벽화로 키우고 있습니다. 우리는 지금 인간적인 현상의 병렬로 이 특성을 사용하여 생물 의학 조사를 실시하고 있습니다. 여기에서 우리는 행동 분석의 전지 및 진화와 생물 의학 연구 둘 다를 위해 이용될 수 있는 분석 시스템을 보여줄 것입니다.
진동이 끌어와 행동을 분석하기 위해 진동 유리 막대가 어둠 속에서 물고기 한 마리가 들어있는 유리 그릇에 삽입됩니다. 물고기는 12, 12 빛, 어두운 주기와 조건부 물에 분석 4 일 전에 적응된다. 분석 일 3 일 적응 후 하루 전에, 신선한 조건부 물로 분석 챔버에서 물을 대체합니다.
분석 당일, 물고기는 분석이 완료 될 때까지 음식을 박탈됩니다, 중단은 진동에 대한 응답을 변경하기 때문에. 40 헤르츠에 튜닝하여 진동 방출 장치를 준비합니다. 적절한 기록 매개 변수, 재고 조건 및 대상 파일을 설정합니다.
녹음 무대에 분석 실린더를 놓고 어두운 방에 적외선 백라이트로 조명을 비추고, 무대에 배치된 후 3분 동안 물고기가 적응할 수 있도록 합니다. 어둠 속에서 3분 동안 적응한 후 3분 30초 분량의 비디오를 녹화합니다. 레코딩이 시작되면 7.5밀리미터 직경의 진동 유리 막대를 수열에 삽입하여 깊이약 5cm입니다.
물고기가 사소한 소음과 진동을 감지 할 수 있기 때문에 물에 진동 유리 막대를 배치하는 동안 소음이나 진동을피하십시오. 비디오 녹화를 시작한 후 30초 이내에 이 절차를 완료하여 3분 이상의 동작이 기록되도록 해야 합니다. avs_creator 두 번 클릭하여 일괄 처리 파일을 실행합니다.
압축 된 AVI 비디오를 ImageJ에 대한 읽을 수있는 형식으로 변환하는 박쥐. 매크로는 그래픽 사용자 인터페이스 셸을 드래그하고 드롭하기만 하면 로드할 수 있습니다. 이 매크로를 사용하면 다음 분석을 위해 특정 단축키가 활성화됩니다.
작업 디렉터리에서 새 폴더를 만들고 이름을 Process_ImageJ. 이 폴더는 다음 분석에서 출력 파일을 저장하는 데 자동으로 사용됩니다. 분석할 AVS 비디오 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 빠른 마운트를 선택합니다.
AVS 파일을 외부 드라이브로 마운트한 후 ImageJ에서 AVI 파일을 엽니다. 거리 측정의 배율을 설정하려면 직선 선택 도구를 사용하여 챔버를 가로질러 직선을 그리는 것으로 분석 챔버의 직경을 선택한 다음 분석, 설정 스케일 함수를 클릭하여 스케일을 설정합니다. 우리의 경우, 우리는 9.4 센티미터를 입력합니다.
다음 모든 비디오 분석에서 축척을 표준화하려면 글로벌 라디오 상자를 선택합니다. 타원형 선택 도구를 사용하여 분석 챔버 영역을 복사한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이미지 중복을 선택합니다. 이 때 추가 분석을 위해 유지할 프레임 범위를 지정합니다.
분석 챔버 의 외부를 지우고 숫자 막대의 핫키 일곱을 타격하여 이미지를 바이너리 이미지로 변환합니다. 배경이 지워진 후에는 이미 채우기 기능을 사용하여 검은색으로 설정된 타원형 선택 도구를 사용하여 진동 유리 막대의 위치를 나타내기 위해 중앙에 검은색 점을 추가하라는 메시지가 표시됩니다. 확인을 클릭하면 매크로가 임계값 조정으로 이동하라는 메시지가 표시됩니다.
전체 비디오 클립에서 물고기를 볼 수 있도록 임계값을 조정한 다음 적용을 선택합니다. 숫자 막대의 핫키 8을 누르면 트래커 플러그인을 실행합니다. 메시지가 표시될 때 최소 픽셀 크기를 100으로 설정합니다.
이 프로세스는 진동 유리 막대와 이진 비디오의 모든 3 분 동안 프레임 당 물고기 사이의 거리를 생성합니다. 트래커 파일을 저장하려면 숫자 막대의 핫키 9를 누르세요. 이렇게 하면 전체 비디오의 이미지의 이진 스택과 좌표 및 거리 데이터가 있는 XLS 파일을 다시 분석해야 하는 경우 자동으로 내보내집니다.
이렇게 하면 현재 비디오와 연결된 모든 파일도 닫힙습니다. 생성된 파일은 이제 특정 연구 질문에 따라 추가로 분석할 수 있습니다. 조건부 물로 채워진 맞춤형 디자인 10리터 아크릴 레코딩 수족관의 각 챔버에서 4일 이상 실험용 물고기 5마리를 접목.
각 챔버는 검은 아크릴 보드로 분리됩니다. 각 탱크는 물고기가 다른 챔버로 점프하지 않도록 커버해야합니다. 프로그래밍 가능한 파워 타이머를 설정하여 백색 LED 조명을 12시간 동안 자동으로 켜고 적응 기간 동안 매일 12시간 동안 꺼집니다.
물고기가 훈련에 취약하면 물고기의 일주기 리듬을 훈련합니다. 보다 확산된 백색광을 제공하기 위해, 우리는 각 탱크에 대한 빛을 통과하는 디퓨저로서 10 리터 탱크와 유사한 차원의 평평한 흰색 불투명 아크릴 보드를 사용합니다. 이 기간 동안, 라이브 소금물 새우와 함께 하루에 한 번 공급하고 각 수족관에서 스폰지 필터를 통해 폭을 제공합니다.
물고기가 일관된 시간에 먹이를 주도록 하십시오. 예를 들어, 아침에 하루에 한 번. 분석 일 전날, 3 일 이상 적응, 신선한 조건부 물로 분석 챔버에서 물을 대체.
VirtualDub 소프트웨어에서 매개 변수 녹음을 설정합니다. 비디오는 고정 된 노출 시간에 초당 15 프레임으로 기록됩니다. 비디오는 X264VFW 코덱으로 압축되어 약 700배의 압축을 달성합니다.
녹음 당일, 살아있는 소금물 새우로 각 물고기를 먹입니다. 모든 스폰지 필터를 제거하고 녹음을 시작합니다. 녹화 단계에서 적외선을 켭니다.
화면에서 VirtualDub 라이브 이미지를 관찰하여 각 수족관의 위치를 조정하여 USB 카메라를 제대로 대면할 수 있도록 합니다. 아침에 24시간 녹음을 시작합니다. 예를 들어 시작 시간은 9a.m입니다.
그리고 마무리 시간은 다음 날 9a.m입니다. 비디오 캡처를 시작하고 방해를 피하기 위해 위치를 확보하십시오.
때때로 레코딩이 실행 중인지 확인합니다. 24시간 녹화 후 비디오가 올바르게 저장되었는지 확인합니다. 비디오를 PC 워크스테이션으로 전송하여 물고기의 동작을 추적합니다.
비디오를 적절한 폴더로 전송한 후 비디오품질 검사를 신속하게 수행하여 품질이 향상되도록 합니다. 여기에는 조명을 보고, 각 섹션에 물고기가 하나 있는지 확인하고, 잘못된 추적을 일으킬 수 있는 외래 움직임이 있는지 확인하는 것이 포함됩니다. 여기에서 프리웨어 SwisTrack은 동물 추적에 사용됩니다.
이 소프트웨어의 장점은 소프트웨어가 한 번에 여러 동물을 추적하고 우리가 식별하는 임의의 프레임을 사용하여 배경 이미지를 뺄 수 있다는 것입니다. 단점은 추적이 다른 물고기를 포함하는 경기장 사이점프 할 수 있다는 것입니다. 배경 이미지는 이후 프레임에 적합하지 않을 수 있으며, SwisTrack은 개별 물고기에 추적 ID를 임의로 할당하므로 각 물고기의 평균 물리적 위치를 플로팅하여 물고기 ID를 복구할 필요가 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 세 가지 방법이 사용됩니다. 이진 마스크의 사용, 짝수 경기장의 추적을위한 하나, 홀수 경기장의 추적에 대한 하나. 윈 자동화를 사용하여 3분마다 배경 이미지를 자동으로 업데이트하고 Perl 스크립트를 사용하여 물고기 ID를 재구성합니다.
분석의 첫 번째 단계는 홀수와 심지어 경기장에 대한 바이너리 마스크를 만드는 것입니다. 비디오 품질을 확인한 후 비디오 편집 소프트웨어에서 대표 프레임을 선택하고 두 개의 이진 마스크를 만드는 데 사용합니다. 이러한 이진 마스크의 목적은 인접한 경기장 간의 잘못된 추적을 피하는 것입니다.
이진 마스크를 만든 후 추적 프로세스의 파일 경로 및 매개 변수를 결정하는 SwisTrack 매개 변수 파일을 엽니다. 비디오 추적을 위해 각 짝수 및 홀수 파일 폴더에 하나의 매개 변수 파일을 준비합니다. 이 파일에서 비디오 및 마스크 파일의 파일 위치에 대한 경로를 입력합니다.
매개 변수 파일을 준비한 후 3분마다 자동으로 배경을 재설정하는 Win-Automation 실행 파일열기를 엽니다. 이 실행 파일을 사용하면 SwisTrack이 자동으로 실행된 다음 이 추적 소프트웨어의 각 짝수 또는 홀수 폴더에 매개 변수 파일을 엽니다. 추적 소프트웨어를 실행하여 물고기의 움직임을 추적합니다.
추적의 처음 9, 000 프레임 내에서 가장 가까운 이웃 추적 구성 요소를 보고 물고기가 제대로 추적되고 있는지 확인합니다. 적절한 설정 추적 후 적응형 배경 뺄셈 구성 요소 탭으로 돌아가 키보드의 핫키 R을 누르고 지속적인 적응형 배경 뺄셈을 위해 Win-Automation을 실행합니다. 약 5시간 후에 각 물고기에 대해 텍스트 파일이 생성되며 비디오의 모든 프레임에 대한 X 및 Y 좌표가 포함됩니다.
분석을 계속하려면 세 개의 Perl 스크립트 파일을 짝수 폴더와 홀수 폴더가 모두 포함된 폴더에 할당합니다. 픽셀 단위로 길이를 센티미터로 변환하려면 센티미터에서 픽셀 비율을 알아야 합니다. 1.fillupGaps.pl 명명된 Perl 스크립트 파일의 적절한 위치에 이 비율을 입력합니다.
1.fillupGaps를 실행합니다. pl Windows용 유닉스 에뮬레이터를 사용하여 펄 스크립트를 작성합니다. 먼저 CD 명령을 사용하여 현재 작업 디렉터리로 이동한 다음 Perl 1.fillupGaps를 입력합니다.
Pl은 펄 스크립트를 실행합니다. 다른 두 스크립트는 순차순서로 자동으로 호출됩니다. 이 세 스크립트는 각 추적 파일을 수족관의 각 섹션에 할당하므로 각 물고기의 동작을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
스크립트를 실행한 후 생성된 Summary_Sleep라는 텍스트 파일을 결합하여 분석에서 삭제된 프레임 수가 허용되지 않는지 다시 확인합니다. 프레임의 15% 미만이 누락된 것은 허용되는 것으로 간주됩니다. 추적 데이터를 사내 매크로가 있는 스프레드시트 파일에 복사하여 붙여넣습니다.
이 매크로는 분석된 데이터를 수면 기간 평균 및 수영 거리 합계와 같은 여러 단계 프로세스 수준으로 재구성합니다. 물고기 측면 라인을 염색하기 위해, 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 최종 농도를 위해 조건부 물에 DASPEI 스톡 솔루션을 용해, 다음 45 분 동안 어두운 환경에서 실온에서 용액에 물고기를 담급. 45분 후, DASPEI 용액에서 물고기를 회수하고 MES 트리플 2로 차가운 컨디셔닝 된 물에 담급드하십시오.
물고기가 깊이 마취되면, 페트리 접시에 물고기를 장착하고 효율적인 현미경으로 관찰. 통계 시리즈를 사용하여 물고기의 모든 계획을 집중하고 모든 것을 하나의 그림으로 컴파일해야 합니다. 이미지 분석을 위해 분석할 사진이 포함된 폴더에 Process_ImageJ 마크러 파일이라는 새 폴더를 추가합니다.
ImageJ 소프트웨어를 열고 매크로 파일을 ImageJ로 드래그하여 매크로를 엽니다. 매크로를 클릭하여 매크로를 실행하고 매크로를 실행합니다. 그림이 자동으로 열리지 않으면 매크로, 파일 픽업을 클릭합니다.
그런 다음 매크로가 자동으로 사진 파일을 픽업하여 분석합니다. 신경종제 정량화는 다각형 2개를 클릭하여 관심 영역을 나타내고, 그림에 영역을 그립니다. 8, 5- 관심 영역중복.
페인트 도구를 사용하여 이전 이미지에서 추가 또는 누락된 점을 제거하거나 추가한 다음 8개, 6점을 추가합니다. 8, 6, 두 개의 새 창이 나타납니다. 번호가 매겨진 신경종점의 구성표와 총 신경종 제수가 있는 테이블이 있는 창.
두 파일을 저장하기 위해 일곱 을 누르고. 확인을 클릭하면 해당 파일이 저장되고 추가 분석을 위해 새 그림 파일이 열립니다. 매크로를 실행하여 신경마비수를 통합합니다.
다음 결과는 통제된 조건하에서 물고기의 두 형태에 대해 기대할 수 있는 무슨의 대표적인 결과입니다. 이 네 가지 수치는 진동 어트랙션 동작 에세이의 대표적인 결과를 보여줍니다. A와 B는 수면 물고기인 A의 수영 길, 동굴 B의 최고 전경입니다.
빨간색 선은 ImageJ 추적에서 생성한 좌표의 추적으로 3분 동안 기록됩니다. C와 D는 TXT 파일에서 스프레드시트 매크로에 의해 추출된 케이어인 C, 표면 물고기 및 D의 결과를 비교합니다. Y축은 물고기가 진동 하는 막대에 접근 한 횟수로 계산됩니다.
각 점은 하나의 물고기의 행동 분석 중에 하나의 실험 관찰을 나타냅니다. 표면 물고기는 어떤 주파수에서 접근의 증가를 표시하지 않습니다, 동굴 물고기는 약 35 ~ 40 헤르츠의 매력의 최대를 표시하는 동안. 이 두 수치는 TXT 파일에서 스프레드시트 매크로에서 추출한 수면 행동 기록의 대표적인 결과를 보여줍니다.
A와 B는 매크로 파일에서 자동으로 요약된 두 메트릭을 보여 줍니다. 그림 A는 표면 물고기와 동굴물고기의 낮과 밤의 수영 거리를 나타내며, B는 두 모프의 수면 시간을 보여줍니다. 이 경우, 케이피류는 표면 물고기에 비해 과잉 행동과 수면이 적어 보였다.
이러한 수치는 TXT 파일에서 스프레드시트 매크로에서 추출한 DASPEI 이미지 분석 결과를 보여 준다. A와 B는 신경마비 수 대 진동 어트랙션 동작과 신경마비의 크기와 동굴, 표면 물고기 및 F1 자손의 동작 사이의 관계를 보여줍니다. 각 점은 각 물고기를 나타냅니다.
참고, 신경 마비 수는 긍정적으로 진동 매력 행동과 상관 관계, 신경 종이 행동을 조절할 수 있습니다 제안. 신경 마비 크기는 또한이 결론을 지원합니다. C와 D는 DASPEI 염색 신경종, 표면 물고기 및 동굴어 D의 예 이미지입니다.
이미지의 각 형광점은 DASPEI를 촬영한 신경종 1개입니다. 참고, 동굴 물고기에 신경 유방의 눈에 띄게 더 큰 풍부. 우리는 측면 라인 기반 행동 수영 활동과 수면에 대한 일련의 행동 분석을 보여주었습니다.
동물 추적 시스템은 또한 고정 반복적 행동, 사회적 상호 작용 및 행동 측면과 같은 다른 행동에 적응할 수 있습니다.
