Davranışsal izleme ve Meksika Cavefish Neuromast görüntüleme

Cavefish evrim ve biyomedikal süreçleri anlamak için fantastik bir hayvan duvar olarak yükseltiyor. Şu anda bu özelliği insan semptomlarına paralel olarak kullanarak biyomedikal araştırma yapıyoruz. Burada hem evrimsel hem de biyomedikal çalışmalarda kullanılabilecek davranış tahlillerinin pilini ve analiz sistemini göstereceğiz.

Titreşim ilerler ve davranış ı saymak için, titreşimli bir cam çubuk karanlıkta bir balık içeren bir cam kaseye yerleştirilir. Balıklar, 12, 12 ışıklı, karanlık bir döngüile şartlı suda denemeden dört gün önce alışılırlar. Üç günlük alışma dan sonra, titreşme gününden bir gün önce, temiz şartlı su ile istinat odasında su değiştirin.

Titrenin olduğu gün, balıklar, titreşme tamamlanana kadar yiyecekten mahrum bırakılırlar, çünkü bırakma titreşimlere olan tepkilerini değiştirir. 40 Hertz'e göre ayarı yaparak titreşim yayan aparathazırlayın. Uygun kayıt parametrelerini, stok koşullarını ve hedef dosyasını ayarlayın.

Karanlık bir odada kızılötesi arka ışıkla aydınlatılan ve balığın sahneye yerleştirildikten sonra üç dakika boyunca alışmalarını sağlayan ses tonu silindirini kayıt aşamasına yerleştirin. Karanlıkta üç dakikalık alışmadan sonra, üç dakika 30 saniyelik video kaydedin. Kaydın başlangıcında, 7,5 milimetre çapında titreşen cam çubuğu su sütununa, yaklaşık 5 santimetre derinliğinde titreşen cam çubuk takın.

Balıklar küçük sesler ve titreşimler algılayabildiği için, titreşen cam çubuğu suya yerleştirirken herhangi bir gürültü veya titreşim yapmaktan kaçının. Üç dakikadan fazla davranışın kaydedilmesini sağlamak için video kaydını başlattıkten sonra 30 saniye içinde bu yordamı tamamladığından emin olun. Toplu iş dosyalarını çift tıklatarak avs_creator çalıştırın.

sıkıştırılmış AVI videosunu ImageJ için okunabilir formata dönüştürmek için yarasa. Makro sadece sürükleyin ve grafik kullanıcı arabirimi kabuğu içine bırakarak yüklenebilir. Bu makro, aşağıdaki çözümleme için belirli anahtar tuşları sağlayacaktır.

Çalışma dizininde, yeni bir klasör oluşturun ve Process_ImageJ. Bu klasör, çıktı dosyalarını aşağıdaki çözümlemeden depolamak için otomatik olarak kullanılır. Analiz edilecek AVS video dosyasına sağ tıklayın ve hızlı montaj seçin.

AVS dosyası harici sürücü olarak monte ediletıldıktan sonra, AVI dosyasını ImageJ'de açın. Mesafe ölçümüölçeğini ayarlamak için, düz çizgi seçim aracını kullanarak oda boyunca düz bir çizgi çizerek sayma odasının çapını seçin ve ardından analiz et, ölçek işlevini ayarla'yı tıklatarak ölçeği ayarlayın. Bizim durumumuz için, 9.4 santimetre giriş yapıyoruz.

Ölçeği aşağıdaki tüm video analizlerinde standartlaştırmak için global radyo kutusunu işaretleyin. Oval seçim aracını kullanarak arama odası alanını kopyalayın ve ardından resim yinelemesini sağ tıklatın ve seçin. Şu anda, daha fazla analiz için tutmak için çerçeve aralığını belirtin.

Sayıştay odasının dışına çıkın ve sayı çubuğundaki hotkey yediye basarak görüntüyü ikili bir görüntüye dönüştürün. Arka plan temizlendikten sonra, dolgu işlevi ile siyaha ayarlanmış oval seçim aracını kullanarak titreşen cam çubuğun konumunu belirtmek için merkeze siyah bir nokta eklemeniz istenir. Tamam'ı tıklatın ve makro eşik ayarı geçmek ister.

Balığın video klibin tamamında görülebilmesi için eşiği ayarlayın ve ardından uygula'yı seçin. Number çubuğundaki hotkey eight tuşuna basarak Tracker eklentisini çalıştırın. İstendiğinde minimum piksel boyutunu 100 olarak ayarlayın.

Bu işlem, ikili videonun üç dakikası boyunca titreşen cam çubuk ile kare başına balık arasındaki mesafeyi oluşturur. İzleyici dosyasını kaydetmek için, sayı çubuğundaki hotkey nine tuşuna basın. Bu, yeniden analiz etmek gerektiğinde, tüm videonun ve koordinatve mesafe verilerini içeren bir XLS dosyasının ikili görüntülerini otomatik olarak dışa aktarır.

Bu da geçerli video ile ilişkili tüm dosyaları kapatır. Oluşturulan dosyalar artık belirli araştırma sorusuna bağlı olarak daha da analiz edilebilir. Klima dört gün veya daha fazla özel bir tasarım 10 litre akrilik kayıt akvaryum klimalı su ile dolu her odada beş deneysel balık.

Her bir oda siyah akrilik tahta ile ayrılır. Balıkların başka bir odaya atlamasını önlemek için her tank örtülmelidir. Programlanabilir güç zamanlayıcısı,beyaz LED ışığını 12 saat boyunca otomatik olarak açmak için ayarlayın ve alışma süresi boyunca her gün 12 saat kapalı.

Eğer balık entrainment duyarlı ise bu balık sirkadiyen ritmi niğve olacaktır. Daha dağınık bir beyaz ışık sağlamak için, her tank için ışık geçirmek için bir difüzör olarak 10 litrelik tank benzer boyutta düz beyaz opak akrilik tahta kullanın. Bu dönemde, günde bir kez canlı salamura karides ile beslenme sağlamak ve her akvaryumda sünger filtre ile havalandırma sağlar.

Not, balıkların tutarlı bir zamanda beslendiğinden emin olun. Örneğin, sabah ları günde bir kez. Bir gün önce, üç gün veya daha fazla alışma, taze şartlı su ile istinat odasında su değiştirin.

VirtualDub yazılımındaki parametreleri kaydedin. Video, sabit pozlama süresi içinde saniyede 15 kare olarak kaydedilir. Video, yaklaşık 700 kez sıkıştırma elde etmek için X264VFW codec'de sıkıştırılır.

Kayıt gününde, her balık canlı salamura karides ile beslemek. Tüm sünger filtresini çıkarın ve kaydetmeye başlayın. Kayıt aşamasındaki kızılötesi ışığı açın.

Ekranda VirtualDub canlı görüntü gözlemleyerek, usb kamera düzgün yüz emin olmak için her akvaryum konumunu ayarlayın. Sabah 24 saat kayıt başla. Örneğin, başlangıç saati 9 a.m.

ve bitiş saati ertesi gün 09:00.m. Videoyu yakalamaya başlayın ve rahatsızlık vermemek için konumu güvenli hale getirmek.

Bazen kaydın çalışır durumda olup olmadığını kontrol edin. 24 saatlik kayıttan sonra, videonun doğru kaydolduğundan emin olun. Balığın davranışını izlemek için videoyu PC iş istasyonuna aktarın.

Videoyu uygun klasöre aktardıktan sonra, kaliteli olduğundan emin olmak için videonun kalite denetimini hızlı bir şekilde yapın. Buna Aydınlatmaya bakmak, her bölümde bir balık olup olmadığını ve yanlış izlemeye neden olabilecek herhangi bir yabancı hareket olup olmadığını kontrol etmek dahildir. Buradan, freeware SwisTrack hayvan izleme için kullanılır.

Bu yazılımın avantajı, yazılımın aynı anda birden fazla hayvanı izleyip tanımladığımız rasgele bir çerçeve yi kullanarak arka plan görüntüsünü çıkarabiliyor olmasıdır. Dezavantajları farklı bir balık içeren arenalar arasında izleme atlamak olabilir. Arka plan görüntüsü sonraki kareler için yeterli olmayabilir ve SwisTrack rastgele tek tek balıkizleme kimliği atar, bu nedenle her balığın ortalama fiziksel konumunu çizerek balık kimliğini kurtarmak için gereklidir.

Bu sorunların üstesinden gelmek için üç yaklaşım kullanılır. Çift numaralı arenaların izlenmesi için bir tane, tek numaralı arenaların izlenmesi için olmak üzere ikili maskelerin kullanımı. Arka plan görüntülerini her üç dakikada bir otomatik olarak güncellemek için Win-automation kullanımı ve balık iliklerini yeniden oluşturmak için Perl komut dosyalarının kullanılması.

Analizin ilk adımı tek ve çift arenalar için ikili maskeler yapmaktır. Video kalitesini kontrol ettikten sonra, bir video düzenleme yazılımında temsili bir çerçeve seçin ve biri çift, diğeri tek numaralı arenalar için olmak üzere iki ikili maske oluşturmak için kullanın. Bu ikili maskelerin amacı bitişik arenalar arasında yanlış izlemeleri önlemektir.

İkili maskeler yaptıktan sonra, izleme işlemi için dosya yollarını ve parametreleri belirleyen SwisTrack parametre dosyalarını açın. Video izleme için çift ve tek dosya klasörlerinin her birinde bir parametre dosyası hazırlayın. Bu dosyada, video ve maske dosyalarının dosya konumlarına giden yolu yazın.

Parametre dosyalarını hazırladıktan sonra, arka planı her üç dakikada bir otomatik olarak sıfırlayan Win-automation çalıştırılabilir dosyasını açın. Bu yürütülebilir dosya ile, SwisTrack otomatik olarak çalışacak ve sonra bu izleme yazılımındaki her çift veya tek klasördeki parametre dosyasını açacaktır. Balığın hareketini izlemek için izleme yazılımını çalıştırın.

İzlemenin ilk 9,000 karesinde, en yakın komşu izleme bileşenine bakarak balığın düzgün bir şekilde izlendiğini sağlayın. Düzgün bir şekilde izleme kurduktan sonra, uyarlanabilir arka plan çıkarma bileşeni sekmesine dönün ve sürekli uyarlanabilir arka plan çıkarma için Win-otomasyonu çalıştırmak için klavyedeki hotkey R tuşuna basın. Yaklaşık beş saat sonra, videonun her karesi için X ve Y koordinatları içeren her balık için metin dosyaları oluşturulur.

Çözümlemeye devam etmek için, üç Perl komut dosyası dosyasını hem çift hem de tek klasörleri içeren klasöre ayırın. Piksellerde uzunluğu santimetreye dönüştürmek için santimetre ile piksel oranını bilmek gerekir. Bu oranı, 1.fillupGaps.pl adlı Perl komut dosyası dosyasının uygun konumuna yazın.

Çalıştırın 1.fillupGaps. windows için bir Unix emülatörü kullanarak pl Perl komut dosyası. Önce, geçerli çalışma dizinine geçmek için CD komutunu kullanın, ardından Perl 1.fillupGaps yazın.

pl Perl komut dosyası çalıştırmak için. Diğer iki komut dosyası otomatik olarak sıralı olarak çağrılır. Bu üç komut dosyası, akvaryumun her bölümüne her izleme dosyasını atar ve böylece her balığın davranışını analiz etmek için kullanılabilir.

Çözümlemeden bırakılan kare sayısının kabul edilemez derecede düşük olup olmadığını iki kez denetlemek için komut dosyalarını çalıştırdıktan sonra oluşturulan Summary_Sleep adlı metin dosyasıyla görüşün. Çerçevelerin %15'inden daha azının kaybolması kabul edilebilir kabul edilir. İzleme verilerini şirket içi makroyla elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve yapıştırın.

Bu makro, analiz edilen verileri uyku süresi ortalaması ve yüzme mesafesi toplamı gibi birkaç adım işlem düzeyine yeniden yapılandıracaktır. Balık lateral hattı leke için, mililitre başına beş mikrogram son konsantrasyon için şartlı suda DASPEI stok çözeltisi eritin, sonra 45 dakika karanlık bir ortamda oda sıcaklığında çözelti içinde balık batırın. 45 dakika sonra, DASPEI çözeltisi balık kurtarmak ve MES üçlü iki ile buz gibi klimalı suya batırın.

Balık derinden anestezi edildikten sonra, bir Petri kabına balık monte ve verimli mikroskop altında gözlemlemek. Odak balık tüm planları dahil etmek ve tek bir resimde her şeyi derlemek için bir istatistik serisi almak emin olun. Görüntü analizi için, analiz edilecek resimleri içeren klasöre Process_ImageJ adında yeni bir klasör ve makro dosyası ekleyin.

ImageJ yazılımını açın ve makro dosyasını ImageJ'e sürükleyerek makroyu açın. Makroları tıklatarak makroyu çalıştırın, makroyu çalıştırın. Resim otomatik olarak açılmıyorsa makroyu, dosya teslim almayı tıklatın.

Makro daha sonra otomatik olarak çözümlemek için bir resim dosyası alacaktır. Nöromast niceliçin çokgen iki tıklayarak ilgi bölgesi gösterir ve resim üzerinde alan çizin. Sekiz, beş, yinelenen ilgi alanı.

Önceki görüntüden sonra sekiz, altı eksik veya ekstra herhangi bir nokta kaldırmak veya eklemek için boya aracını kullanın. Sekiz, altı, iki yeni pencere belirecek. Numaralanmış nöromast noktalarını gösteren bir pencere ve toplam nöromast sayısallaştırılmış bir tablo içeren bir pencere.

Her iki dosyayı da kaydetmek için yediye bas. Tamam'ı tıklattığınızda, bu dosyalar depolanır ve daha fazla analiz için yeni bir resim dosyası açılır. Makro çalıştırarak nöromast sayısını pekiştirin.

Aşağıdaki sonuçlar, kontrollü koşullarda her iki balık morfolojisi için beklenebilecek lerin temsili sonuçlarıdır. Bu dört rakam titreşim çekim davranış tahlilleri temsili sonuçları göstermektedir. A ve B, A, yüzey balığı ve B bir mağara balığının yüzme yolunun en iyi manzaralarıdır.

Kırmızı çizgiler, ImageJ izlemesinin üç dakikalık kayıt boyunca oluşturduğu koordinatların izleridir. C ve D, TXT dosyalarından elektronik tablo makrosu tarafından çıkarılan C, yüzey balığı ve bir mağara balığı olan D'den elde edilen sonuçların karşılaştırmasını gösterir. Y ekseni, balığın titreşen çubukla kaç kez yaklaştığını sayan sayıdır.

Her nokta bir balığın davranışsal tsonu sırasında bir deneysel gözlemi temsil eder. Yüzey balıklarının herhangi bir frekansta yaklaşımlarda bir artış göstermediğini, mağara balıklarının ise 35-40 Hertz civarında maksimum çekim gösterdiğini unutmayın. Bu iki rakam, TXT dosyalarından elektronik tablo makroları tarafından çıkarılan uyku davranışı tahlillerinin temsili sonuçlarını gösterir.

A ve B, makro dosyası tarafından otomatik olarak özetlenen ölçümlerden ikisini gösterir. Şekil A yüzey balıkları ve mağara balıkları için gündüz ve gece yüzme mesafesini gösterirken, B her iki morfiçin de uyku süresini gösterir. Bu durumda, mağara balıkları yüzey balıklarına göre hiperaktivite ve daha az uyku gösterdi.

Bu rakamlar, TXT dosyalarından elektronik tablo makrosu tarafından çıkarılan DASPEI görüntü çözümlemesi sonuçlarını gösterir. A ve B, nöromast sayısı ile titreşim çekim davranışı ve nöromast boyutu arasındaki ilişkiyi mağara balıkları, yüzey balıkları ve F1 soyundan gelen davranışlara karşı gösterir. Her nokta her balığı temsil eder.

Not, nöromast numarası olumlu titreşim çekim davranışı ile ilişkilidir, nöromast bu davranışı düzenleyebilir düşündüren. Neuromast boyutu da bu sonucu destekler. C ve D, daspei lekeli nöromast C, bir yüzey balığı ve D, bir mağara balığı örnek görüntülerivardır.

Görüntülerdeki her floresan nokta dadaspei almış bir nöromast vardır. Dikkat, mağara balıkları üzerinde nöromasts fark büyük bolluk. Yanal çizgi bazlı davranış yüzme aktivitesi ve uyku için bir dizi davranış analizi gösterdik.

Hayvan takip sistemi de diğer davranışlara adapte edilebilir, stereotipik tekrarlayan davranışlar gibi, sosyal etkileşimler, ve davranışsal yanallık.