洞窟フィッシュは、進化と生物医学的プロセスを理解するために素晴らしい動物の壁画として育てています。私たちは現在、これらの形質を人間の症状の平行線として使用して生物医学的調査を行っています。ここでは、進化研究と生物医学的研究の両方に使用できる行動アッセイと分析システムのバッテリーを示します。
アッセイ振動が引き付け、行動を起こします, 振動ガラス棒は、暗闇の中で1匹の魚を含むガラスボウルに挿入されます.魚は、12、12光、暗いサイクルで条件付き水でアッセイの4日前に順応されます。アッセイの日の前日に、順応の3日後に、アッセイ室の水を新鮮な条件水に置き換えます。
アッセイの日には、停止が振動に対する反応を変えるので、魚はアッセイが完了するまで食べ物を奪われます。40ヘルツにチューニングすることにより、振動放出装置を準備します。適切な記録パラメータ、ストック条件、および出力先ファイルを設定します。
暗い部屋に赤外線バックライトで照らされた記録段階にアッセイシリンダーを置き、魚がステージに置かれた後3分間順応できるようにします。暗闇の中で3分間順応した後、3分30秒のビデオを記録します。録音の始まりに、直径7.5ミリメートルの振動ガラス棒を水柱に挿入し、深さ約5センチメートル。
魚は小さな騒音や振動を感知することができるので、振動ガラスロッドを水中に配置しながら、騒音や振動を避けてください。ビデオ録画を開始してから 30 秒以内にこの手順を完了し、3 分以上の動作が記録されるようにしてください。avs_creatorダブルクリックしてバッチ ファイルを実行します。
は、圧縮された AVI ビデオを ImageJ 用の読み取り可能な形式に変換します。マクロは、グラフィカルユーザーインターフェースシェルにドラッグアンドドロップするだけでロードできます。このマクロは、次の分析に特定のホットキーを有効にします。
作業ディレクトリに新しいフォルダを作成し、Process_ImageJ名前を付けます。このフォルダは、次の分析の出力ファイルを自動的に格納するために使用されます。分析するAVSビデオファイルを右クリックし、クイックマウントを選択します。
AVS ファイルを外付けドライブとしてマウントしたら、ImageJ で AVI ファイルを開きます。距離測定のスケールを設定するには、直線選択ツールを使用してチャンバを横切って直線を描いてアッセイチャンバーの直径を選択し、クリックして分析し、スケール機能を設定します。私たちの場合は、9.4センチメートルを入力します。
次のすべてのビデオ分析でスケールを標準化するために、グローバルのラジオボックスをチェックします。楕円形選択ツールを使用してアッセイチャンバー領域をコピーし、右クリックして画像の複製を選択します。この時点で、さらなる解析のために保持するフレームの範囲を指定します。
アッセイ室の外をクリアし、数字バーのホットキー7を押して画像をバイナリ画像に変換します。背景がクリアされると、塗りつぶし機能で既に黒に設定されている楕円形の選択ツールを使用して、振動ガラスロッドの位置を示す黒い点を中央に追加するように求められます。[OK] をクリックすると、マクロがしきい値調整に進むよう求められます。
ビデオクリップ全体で魚が見られるようにしきい値を調整し、[適用]を選択します。番号バーのホットキー8を押してトラッカープラグインを実行します。プロンプトが表示されたら、最小ピクセル サイズを 100 に設定します。
このプロセスは、バイナリビデオのすべての3分間、振動ガラスロッドとフレームあたりの魚の間の距離を生成します。トラッカーファイルを保存するには、数字バーのホットキー9を押します。これにより、再分析が必要な場合に備えて、ビデオ全体の画像のバイナリスタックと座標と距離データを含むXLSファイルが自動的にエクスポートされます。
また、現在のビデオに関連付けられているすべてのファイルが閉じられます。生成されたファイルは、特定の研究の質問に応じてさらに分析できるようになりました。カスタムデザインの各チャンバーに4日以上5個の実験魚を順応し、10リットルアクリル記録水槽を条件付き水で満たします。
個々のチャンバーは黒いアクリル板で分かれています。各タンクは、魚が別の部屋に飛び込むのを防ぐために覆われなければなりません。プログラム可能な電源タイマーを設定して、12時間の白色LEDライトを自動的に点灯し、順応期間中は毎日12時間オフにします。
これは、魚が巻き込みの影響を受けやすい場合、魚の概日リズムを巻き込みます。より拡散した白色光を提供するために、我々は各タンクの光を通過するディフューザーとして10リットルタンクと同様の次元の平らな白色の不透明なアクリルボードを使用しています。この期間中、生きた塩水エビを1日1回供給し、各水族館のスポンジフィルターを通して通食を提供します。
注意, 魚は一貫した時間に供給されていることを確認します。.たとえば、朝に 1 日に 1 回。アッセイの前日の前日には、3日以上の順応が、アッセイ室の水を新鮮な条件水に置き換えます。
VirtualDubソフトウェアでのパラメータの記録を設定します。ビデオは、固定露出時間で毎秒15フレームで記録されます。ビデオは X264VFW コーデックで圧縮され、約 700 回の圧縮を実現します。
録音の日に、生きた塩水エビを各魚に与えます。スポンジフィルターをすべて取り外し、録音を開始します。記録段階で赤外線を点灯します。
画面上でVirtualDubライブ画像を観察することにより、彼らは正しくUSBカメラに直面していることを確認するために、各水槽の位置を調整します。午前中に24時間録画を開始します。たとえば、開始時刻は 9 a.m です。
そして、終了時刻は、次の日に9.mです。映像のキャプチャを開始し、妨害を避けるために場所を確保します。
録画が実行されているかどうかを確認する場合があります。24 時間録画した後、ビデオが正しく保存されていることを確認します。ビデオをPCワークステーションに転送して、魚の動作を追跡します。
適切なフォルダにビデオを転送した後、すぐにそれが良い品質であることを確認するために、ビデオの品質チェックを行います。これには、照明を見ること、各セクションに魚が1匹あるかどうか、そして誤った追跡を引き起こす可能性のある外国の動きがあるかどうかを確認することが含まれます。ここから、フリーウェアSwisTrackは動物追跡のために使用されます。
このソフトウェアの利点は、ソフトウェアが一度に複数の動物を追跡し、我々が識別任意のフレームを使用して背景画像を減算できることです。欠点は、追跡が別の魚を含むアリーナの間でジャンプする可能性があります。背景画像は後のフレームには不十分であり、SwisTrackは個々の魚に追跡IDをランダムに割り当てるため、各魚の平均物理的位置をプロットして魚のIDを回復する必要があります。
これらの問題を解決するために、3 つのアプローチを使用します。バイナリマスクの使用、偶数のアリーナの追跡のための1つ、奇数のアリーナの追跡のための1つ。Win-automation を使用して 3 分ごとにバックグラウンド イメージを自動的に更新し、Perl スクリプトを使用して魚の ID を再構築します。
分析の最初のステップは、奇数と偶数のアリーナのためのバイナリマスクを作るです。ビデオの品質を確認した後、ビデオ編集ソフトウェアで代表フレームを選択し、それを使用して、偶数用と奇数のアリーナ用の2つのバイナリマスクを作成します。これらのバイナリマスクの目的は、隣接するアリーナ間の誤った追跡を避けることです。
バイナリマスクを作成した後、追跡プロセスのファイルパスとパラメータを決定するSwisTrackパラメータファイルを開きます。ビデオトラッキング用の偶数および奇数のファイルフォルダのそれぞれに1つのパラメータファイルを用意します。このファイルには、ビデオファイルとマスクファイルのファイルの場所へのパスを入力します。
パラメータ ファイルを準備した後、3 分ごとにバックグラウンドを自動的にリセットする Win-automation 実行可能ファイルを開きます。この実行可能ファイルを使用すると、SwisTrackは自動的に実行され、このトラッキングソフトウェアの各偶数または奇数フォルダのパラメータファイルを開きます。追跡ソフトウェアを実行して、魚の動きを追跡します。
トラッキングの最初の 9,000 フレーム以内で、最も近い近隣追跡コンポーネントを見て、魚が適切に追跡されていることを確認します。トラッキングを適切に確立した後、適応型バックグラウンド減算コンポーネントタブに戻り、キーボードのホットキーRを押して、継続的な適応背景減算のためにWin-automationを実行します。約 5 時間後、各魚に対してテキスト ファイルが生成され、ビデオの各フレームの X 座標と Y 座標が含まれます。
分析を続行するには、3 つの Perl スクリプト ファイルを、偶数フォルダーと奇数フォルダーの両方を含むフォルダーに割り当てます。ピクセル単位の長さをセンチメートルに変換するには、センチメートル対ピクセル比を知る必要があります。この比率を、1.fillupGaps.plという名前の Perl スクリプト ファイルの適切な場所に入力します。
1.fillupGapsを実行します。pl のスクリプトは、Windows 用の Unix エミュレータを使用しています。まず、CD コマンドを使用して現在の作業ディレクトリに移動し、次に Perl 1.fillupGaps と入力します。
pl を使用して Perl スクリプトを実行します。他の 2 つのスクリプトは自動的に順番に呼び出されます。これら 3 つのスクリプトは、各追跡ファイルを水槽の各セクションに割り当てるため、各魚の動作を分析するために使用できます。
スクリプトの実行後に生成される Summary_Sleep という名前のテキスト ファイルに、解析から削除されたフレーム数が許容できるほど少ないことが再確認されます。フレームの数が 15% 未満の場合は、許容できると見なされます。追跡データをコピーして、社内マクロを使用してスプレッドシート ファイルに貼り付けます。
このマクロは、解析されたデータを、睡眠時間の平均や水泳距離の合計など、いくつかのステッププロセスレベルに再構築します。魚の側面線を染色するために、DASPEIストック溶液を1ミリリットル当たり5マイクログラムの最終濃度に調整水に溶解し、暗い環境で室温で魚を溶液に浸漬します。45分後、DASPEI溶液から魚を回収し、MESトリプル2で氷冷水に浸します。
魚が深く麻酔されたら、ペトリ皿に魚を取り付け、効率的な顕微鏡で観察します。焦点に魚のすべての計画を含めるために統計シリーズを取り、単一の画像ですべてをコンパイルすることを確認してください。イメージ分析の場合は、Process_ImageJと題する新しいフォルダーを追加し、マクロ ファイルを分析する画像が格納されているフォルダーに追加します。
ImageJソフトウェアを開き、マクロファイルをImageJにドラッグしてマクロを開きます。マクロをクリックしてマクロを実行し、マクロを実行します。画像が自動的に開かない場合は、マクロ、ファイルピックアップをクリックします。
マクロは、分析する画像ファイルを自動的にピックアップします。ニューロマスト定量の場合は、ポリゴン2をクリックして対象領域を示し、画像上に領域を描画します。8、5は関心のある地域を複製します。
ペイント ツールを使用して、前のイメージから余分なドットや欠損している点を削除または追加し、その後 8、6 を追加します。8、6、2つの新しいウィンドウが表示されます。番号付きニューロマストドットのスキームを示すウィンドウと、総神経マストを定量化したテーブルを持つウィンドウ。
両方のファイルを保存するには、7を押します。[OK] をクリックすると、これらのファイルが保存され、新しい画像ファイルが開き、さらに分析されます。マクロを実行してニューロマスト数を統合します。
以下の結果は、制御条件下で魚の両方の形態に期待できるものの代表的な結果である。これらの4つの図は、振動引力行動アッセイの代表的な結果を示しています。AとBは、A、表面魚、およびB洞窟魚の水泳経路の最も高い景色です。
赤い線は、3分間の記録で ImageJ トラッキングによって生成された座標のトレースです。C と D は、TXT ファイルからスプレッドシート マクロによって抽出された C、表面魚、および洞窟魚 D の結果の比較を示します。Y軸は、魚が振動ロッドに接近した回数をカウントします。
各ドットは、1つの魚の行動アッセイ中の1つの実験的観察を表す。表面魚はどの周波数でもアプローチの増加を示さないのに対し、洞窟魚は35〜40ヘルツの周りに最大の魅力を示していることに注意してください。これらの2つの図は、TXTファイルからスプレッドシートマクロによって抽出された睡眠行動アッセイの代表的な結果を示しています。
A と B は、マクロ・ファイルによって自動的に要約される 2 つのメトリックを示します。図Aは、表面魚と洞窟魚の昼間と夜間の泳ぐ距離を示し、Bは両方のモーフの睡眠時間を示しています。この場合、洞窟魚は表面魚と比較して多動性と睡眠不足を示した。
これらの図は、TXTファイルからスプレッドシートマクロによって抽出されたDASPEI画像分析の結果を示しています。AとBは、ノイロマスト数と振動引力挙動とニューロマストサイズと洞窟魚、表面魚、およびF1子孫の行動との関係を示す。各ドットは各魚を表します。
なお、神経マスト数は振動引力の挙動と正の相関を示し、ニューロマストがこの挙動を調節する可能性があることを示唆している。ニューロマストサイズもこの結論をサポートしています。CおよびDは、CのDASPEI染色された神経マスト、表面魚、およびD、洞窟魚の画像の例である。
画像内の各蛍光ドットは、DASPEIを取り上げた1つのニューロマストです。注意, 洞窟魚の神経マストの顕著に大きな豊富さ.我々は、横線ベースの行動水泳活動と睡眠に関する一連の行動分析を示した。
動物追跡システムは、立体的な繰り返し行動、社会的相互作用、行動の横性などの他の行動にも適応することができる。
