Zika와 에볼라 바이러스와 같은 최근 전염병의 업틱은 글로벌 규모에서 보다 조정되고 민첩한 반응의 필요성을 강조했습니다. 이를 위해 당사는 이러한 발병 시 전 세계적으로 자원이 제한된 지역에서 사용할 혁신적이고 확장 가능한 인모달 실험실 유닛을 설계했습니다. 여기에서 우리는 우리의 인트라 모달, 확장 가능한 모바일 선적 컨테이너 실험실을 제시합니다.
그리고 다음 논문에서, 우리는 호흡 인플루엔자 바이러스 진단에 우리의 BSL-2 및 BSL-3 접근을 제시합니다. RCT-PCR에 의한 신속한 인플루엔자 바이러스 진단. 설치된 실험실 장치에 진입하기 전에 모든 BSL-2 안전 요구 사항을 고려해야 합니다.
여기에는 적절한 개인 보호 장비가 있는 드레싱, 손 씻기, 장갑 착용, 사용하려는 작업 공간 제거 가 포함됩니다. 표백제를 사용하여 작업 공간과 소모품을 오염 제거하는 경우, 표백제가 작업 공간의 다른 화학 물질과 혼합하여 독성 연기를 만들 수 있으므로 70%의 에탄올을 사용하여 표백제에 노출된 모든 영역을 청소해야 합니다. 모든 표백제 제품을 자신의 지정된 쓰레기통에 보관하십시오.
샘플 면봉은 환자에게서 취하면 현장이나 클리닉에서 실험실 시설로 이송되어 통과 창을 통해 실험실 기술자에게 전달됩니다. 이 창은 양쪽에서 열 수 없습니다. BSL-2 통과 창에서, 견본을 포함하는 관의 외부 표면은 표백제로 완전히 disindind및 2 분 동안 앉기 위하여 혼자 남겨두어야 합니다.
통과 창을 열고 등록할 샘플을 수집합니다. 표백제잔해가 남아 있는 샘플을 닦아내고, 표백제로 통과 창 의 내부를 닦은 다음 70% 에탄올 용액을 닦아냅니다. 각 샘플 튜브에 바코드를 추가하고 알리쿼트로 지정된 4개의 빈 튜브를 추가합니다.
샘플을 통풍구 후드로 이동합니다. 각 튜브의 바코드를 스캔하고 태블릿 기반 시스템 또는 랩톱 화면에 적절한 샘플 식별 정보가 나타나는지 확인합니다. 등록 절차를 완료합니다.
샘플 알리쿼트. 테스트 튜브가 라벨이 붙으면 인증되고 오염되지 않은 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하여 시료를 알리쿼트로 채취하십시오. aliquots를 복용할 때는 각 샘플에 신선한 멸균 또는 일회용 파이펫을 사용하고 교차 오염을 방지하기 위해 생물 유해 폐기물 용기에 버려야 합니다.
모든 튜브가 단단히 밀봉되고 닫혀 있는지 확인하십시오. 시편당 알리쿼트 1개를 활용하여 즉각적인 추출을 하십시오. 나중에 사용할 수 있는 냉동실에 다른 알리코를 보관하십시오.
워크스테이션으로 이동하기 전에 표백제로 모든 작업 공간 표면과 장비를 청소한 다음 70%에탄올 용액을 세척합니다. 바코드 PCR 샘플이 알리인용되면 추출을 위해 지정된 워크스테이션으로 이동합니다. 용해 단계를 위해 완충액 AVL 담체 RNA 혼합물을 준비하십시오.
샘플 및 리시스 버퍼 마스터 믹스는 실온에서 유지되어야 합니다. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 라벨을 부착하십시오. 파이펫 팁을 560 마이크로리터로 설정합니다.
깨끗한 파이펫 팁을 바르습니다. 각 튜브에 리시스 버퍼를 추가합니다. 폐 용기에 팁을 버리십시오.
다음으로 PCR 알리쿼트 샘플을 가져 가라. aliquot 하나에 지정된 준비된 용해 버퍼 튜브에 넣고 추가 샘플에 대해 반복합니다. 오래된 파이펫 팁을 버리고 깨끗한 파이펫 팁을 적용합니다.
깨끗한 파이펫 팁을 바르습니다. 제어 튜브에 버퍼 140 마이크로리터를 추가합니다. 각 튜브를 안전하게 닫습니다.
15초 동안 펄스 소용돌이. 추가 알리쿼트 또는 샘플과 함께 반복합니다. 5초 동안 각 시료를 미세원심분리합니다.
실온에서 10분 동안 배양하세요. 10 분 후 간략하게 원심 분리하여 각 튜브 뚜껑 의 내부에서 방울을 제거하십시오. 샘플에 560 마이크로리터의 에탄올을 추가합니다.
파이펫 팁을 변경합니다. 남은 샘플이나 추가 샘플과 함께 반복합니다. 각 샘플 튜브를 안전하게 닫습니다.
펄스 소용돌이 각 샘플은 15초 동안. 미세 원심 분리는 5 초 동안 샘플을 분리합니다. 깨끗한 2 밀리리터 수집 튜브를 가져옵니다.
스핀 열을 추가합니다. 샘플에 맞게 레이블을 지정합니다. 그에 따라 컬럼에 맞게 샘플의 630 마이크로리터를 전송합니다.
캡을 보호합니다. 원심분리기로 이동합니다. 원심분리기에 샘플을 균등하게 분배합니다.
6000 g의 원심분리기는 1분 동안 리시스 버퍼를 제거합니다. 워크스테이션으로 돌아갑니다. 수집 튜브를 교체합니다.
나머지 리시스 버퍼를 추가하고 원심 분리 단계를 반복합니다. 원래 알리쿼트 샘플 튜브를 폐기한 후 용액을 폐기하고 완충액 AW1로 스핀 컬럼을 세척합니다. 모든 샘플 또는 추가 샘플과 함께 이 절차를 반복합니다.
각 샘플의 캡과 원심분리기를 6g으로 고정합니다. 20g에서 두 번째 세척 버퍼 AW2로 반복하십시오. 마지막으로, 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브에 열을 놓습니다.
컬럼을 열고 60 마이크로리터의 완충AVE. 실온에서 1분 동안 인큐베이션을 추가하고 1분 동안 6g의 원심분리기를 넣습니다. 이제 샘플이 PCR 분석을 위한 준비가 되었습니다.
BSL-3 조건하에서 실험 프로토콜은 동일하게 유지되지만 안전 조치는 다른 어떤 것보다선 선례를 취할 것입니다. BSL-3 실험실에 들어가기 전에 투명 창을 통해 확인하여 글러브박스 장치에 음압이 확립되었는지 확인합니다. 벽에 있는 공이 보이면 부정적인 압력이 확립되었음을 알 수 있습니다.
음의 압력이 설정되면 문을 열고 장치를 입력합니다. 즉시 손을 씻은 다음 PPE 체크리스트로 진행하십시오. 장갑, 가운, 신발 커버, 마스크, 얼굴 방패, 장갑 두 번째 쌍 : 다음 순서로 PPE에 넣어 진행합니다.
기계를 켜고 장갑상자의 압력이 안정화되도록 합니다. 표백제 스프레이 솔루션을 사용하여 모든 영역을 오염제거하고 글러브박스 안팎에서 사용할 수 있는 물품을 공급합니다. 표백제 폐기물을 표백제 전용 용기에 넣습니다.
70% 에탄올 용액을 사용하여 표백제가 사용된 모든 영역에 대해 청소하십시오. 통과 창을 통해 샘플을 전송합니다. 샘플은 표백제 용액으로 분사되고 BSL-3 유닛 내부에 들어가기 전에 통과시 적어도 1 분 동안 혼자 남겨두어야합니다.
다음으로, BSL-3 장치 내부에 샘플을 수신하고 등록 및 라벨링 단계로 진행하기 전에 철저하게 청소하십시오. 샘플이 등록되고 튜브에 레이블이 지정되면 에어록 트레이를 통해 샘플을 글러브박스에 넣습니다. 한 번에 두 문을 열지 마십시오.
안전 예방 조치를 위해 두 단계로 각 문을 열고 닫습니다. 샘플이 글러브박스 내부로 안전하게 이동되면 글러브박스에 샘플 알리쿼트를 만들기 위해 이전에 설명한 것과 동일한 단계를 따르십시오. 샘플이 알리인용되면 샘플을 밀폐 용기로 이동합니다.
글로브박스 내에 표백제 용액을 분사하여 튜브 및 기타 모든 표면을 오염제거합니다. 5분간 기다린 다음 70% 에탄올 용액을 적용하여 표백제를 세척합니다. 철저한 오염 제거 후 용해가 글러브 박스로 다시 단계로 돌아 간 PCR 분석에 필요한 샘플만 이동합니다.
글러브박스에서 추출 절차의 리시스 단계만 수행합니다. 세포가 용해되면 각 샘플의 캡을 단단히 밀봉하여 가압 된 에어록 통로에 넣습니다. 70%에탄올 용액이 표백제로 글러브박스를 다시 오염 제거합니다.
샘플을 글러브박스 밖으로 옮기고 추출 절차의 나머지 단계를 위해 워크스테이션으로 옮습니다. 추출 후 샘플을 PCR 분석을 위한 통과 창으로 전송합니다. 샘플을 제거하고 옮김한 후, 글러브박스 외부의 실험실 작업 공간을 오염제거합니다.
PPE를 제거하기 전에 PPE를 제거하기 전에 장치의 공기 순환이 적절한 수의 필터링 주기에 안전하게 도달 할 때까지 기다립니다. PPE 폐기물 용기에 모든 PPE를 제거하고 폐기한 직후, 장치를 종료하기 전에 비누와 물로 실험실 싱크대에 손을 씻는다. PCR 증폭 및 검출.
통과 창에서 추출된 RNA 샘플을 제거합니다. 물, 프라이머 및 프로브, 공격 혼합물 및 2X 버퍼 : 각 대상 분석기다음 구성 요소와 1.5 밀리리터 튜브에서 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이와 마스터 믹스를 회전, 그 후, 스트립 튜브의 각각에 마스터 믹스를 알리 쿼트.
마스터 믹스가 준비되면 PCR 키트를 권장 온도에서 보관하도록 반환합니다. 각 스트립 튜브 사이에 별도의 팁을 사용하여 각 스트립 튜브에 샘플을 추가합니다. 샘플을 1, 500 rpm에서 1분 동안 회전하면 샘플을 실시간 PCR 장치에 로드할 수 있습니다.
샘플이 PCR 기기에 로드되면 한 번의 실행을 완료하는 데 약 90분이 걸립니다. 실시간 PCR 분석법은 바이러스의 강력한 검출을 위한 민감한 방법입니다. 이는 다음과 같은 표에서 볼 수 있습니다:PCR 분석 결과.
결과를 수집하고 실험실을 떠나기 전에 PPE를 제거하고 다음 진단 테스트를 준비하기 위해 각 워크스테이션을 적절하게 오염 제거합니다. 대표적인 결과. 실험실 워크플로우는 개인 보호를 강조하는 다이어그램에 표시됩니다.
인플루엔자의 신속한 진단 시험은 RT-PCR 분석을 통해 수행됩니다. 절차는 네 가지 주요 단계로 구성되며 프로토콜의 각 단계에 대해 개별 작업 영역이 할당됩니다. 이 프로젝트의 목표는 새로운 모듈형 빠르게 배포 가능한 실험실 시설을 검증하는 것이며, 전염병 및 발병 시 자원이 부족한 환경에서 일하는 실험실 직원을 위한 교육 프로그램을 성공적으로 개발했습니다.
