تشريح إشارات الكالسيوم في القرار الخلوي الفرعي، هي واحدة من أهم الخطوات لفك رموز إشارات الكالسيوم داخل الخلوية التي تحدد الظاهرة البيولوجية الناتجة. يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتصوير الكالسيوم التي تمكن من رصد لحظة تدفق الكالسيوم وإطلاق الكالسيوم. هذا البروتوكول ينطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا.
ونحن نعتقد أن لدينا طريقة لديها القدرة على توسيع لتشريح إشارات الكالسيوم في القرار دون الخلوية في الحيوانات الحية في ثقافة المختبر. المساعدة في إثبات الإجراء سيكون ماتسومي هيروز، وهو فني من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، ضع 18 ملليمتر قطرها غطاء زجاجي زلة في كل بئر من لوحة 12 جيدا.
استخدام المياه المعقمة، وإعداد 12.5 ملليلتر من حل 0.4٪ PEI لكل 12 لوحة آبار المستخدمة. أضف ملليلتر واحد من حل PEI لكل بئر ، وتأكد من عدم وجود فقاعات تحت زلات الغطاء. احتضان على مدى الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، استخدم جهاز الطامر لإزالة حل PEI. أضف ملليلتر واحد من المياه المعقمة إلى كل بئر واهتزز الطبق بحيث يتم غسل محلول PEI بين زلة الغطاء واللوحة جيدًا. كرر هذه العملية غسل مرتين إضافية مع المياه الطازجة معقمة.
بعد الغسيل النهائي، يُشعّر الماء من كل بئر تماماً. داخل غطاء محرك السيارة، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتجفيف وتعقيم زلات الغطاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. يمكن تخزين الطبق المغلف PEI في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
عندما تكون جاهزة للمتابعة، تضيء الأطباق مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، قبل الاستخدام. إضافة خمسة ملليلترات من الماء المقطر العقيم في المساحة بين الآبار لمنع تبخر الوسط الثقافي. أولا، غسل الكورتيز مع المالحة الحضانة.
ثم، احتضان الكورتيسيس مع تريبسين وDNAse في الملح حضانة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. ثم، وغسل الكورتيسوس ثلاث مرات مع الملحية حضانة الجليد الباردة. إزالة عظمى وإضافة ملليلتر اثنين من طلاء المتوسطة تكملها 150 ميكرولترات من DNAse I الأسهم.
افصل الخلايا عن طريق الأنابيب عشرين مرة أو أقل وتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع حجم المسام من 70 ميكرومتر. بعد ذلك، قم بغسل مصفاة الخلايا بـ 20 ملليلتر من وسط الطلاء. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة ، قم بغسل الخلايا بـ 20 ملليلترًا من وسط الغسيل.
تخفيف الخلايا القشرية مع متوسط الطلاء إلى كثافة 140 000 خلايا قابلة للحياة لكل ملليلتر. ثم، إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخففة إلى زلات الغطاء المغلفة PEI في لوحات ثقافة 12 جيدا. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.
عندما تكون الخلايا مستقرة، من يومين إلى ثلاثة أيام بعد الطلاء، تغيير متوسطة الثقافة إلى وسط الصيانة. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة، تدور أسفل الخلية، وذلك باستخدام الدوار سوينغ إلى الطرد المركزي الخلايا في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهمي المناط وأضيفي وسط الحفظ بالتبريد، الذي يتم الاحتفاظ به عند أربع درجات مئوية، للحصول على كثافة خلايا تبلغ 10 ملايين خلية لكل ملليلتر.
Aliquot ملليلتر واحد من تعليق الخلية في أنابيب المبردة. ضع الأنابيب في حاوية تجميد الخلايا بمعدل تجميد ناقص درجة مئوية واحدة في الدقيقة ، حتى يتم الوصول إلى درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. نقل حاوية التجميد إلى ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية.
لإحياء الخلايا المجمدة، قبل الدفء وسط الغسيل وصيانة المتوسطة للخلايا القشرية المجمدة. بعد ذلك، ذوبان الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. تمييع الخلايا بلطف مع غسل ما قبل الدافئة المتوسطة والطرد المركزي مع الدوار أرجوحة في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق.
إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من غسل المتوسطة وقياس كثافة الخلية قابلة للحياة. ثم، تمييع الخلايا مع وسيط الصيانة للخلايا القشرية المجمدة، لتحقيق كثافة الخلية من 300 000 خلية لكل ملليلتر. سيّد ملليلتر واحد من هذا تعليق خلية داخل الآبار من ال [بي]12 اغطية بئر ألواح.
بالنسبة للحمّل من ثلاثة إلى ثمانية أيام بعد الطلاء، صمّن أنبوبين، أحدهما للحمض النووي بلازما والآخر لمكشف نقل الدم. إضافة 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في بئر, إلى كل أنبوب. إضافة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما لكل زلة الغطاء وميكر واحد من الملحق يرافقه كاشف transfection للخلايا العصبية، في بئر إلى أنبوب الحمض النووي البلازما.
لTrans-transfection من Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f, مزيج 0.5 ميكروغرام من كل بلازميد وميكر واحد من الملحق في 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في البئر. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من كاشف transfection في بئر إلى أنبوب كاشف transfection. دوامة كلا الأنابيب لمدة ثانية إلى ثانيتين.
ثم، إضافة خليط كاشف transfection إلى خليط الحمض النووي. ماصة بلطف لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تحميل هذا الخليط على الخلايا بطريقة قطرة الحكيمة.
احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم التعبير عن البروتينات علامة. مزيج L و O لجعل عدوى AAC. إضافة ثلاثة microliters من AAC في البئر إلى ثقافة الخلايا العصبية المختلطة استروسييت.
صخرة بلطف الطبق لخلط. الحفاظ على الثقافة لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى يتم التعبير عن GECIs. قم أولاً بتركيب زلة الغلاف التي تحتوي على الخلايا التي تحتوي على الخلايا العابرة مع Lck-RCaMP2 و OER-CaMPG6f في غرفة التسجيل للمجهر.
أضف 400 ميكرولترات من وسط التصوير وضع غطاء على أعلى الغرفة. اختر مجموعة المرشح لGCaMP6f ومصدر الضوء. تحديد موقع الخلايا الفلكية التعبير عن OER-GCaMP6f.
بعد ذلك، اختر مجموعة مرشح ومصدر ضوء لRCaMP2 وتأكد ما إذا كان يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 في نفس الخلايا الفلكية. سجل الصور الفاصل الزمني لـ Lck-RCaMP2 في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. بعد ذلك، تغيير عامل التصفية تعيين إلى ذلك لGCaMP6f.
سجل الصور الفاصل الزمني من OER-GCaMP6f في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. في هذه الدراسة، يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا HeLa وتم تسجيل كلتا الإشارات في وقت واحد باستخدام البصريات تقسيم الصورة، بعد 24 ساعة من نقل. عند إضافة الهستامين، زادت شدة إشارة Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.
يتم مقارنة الدورات الزمنية لارتفاع أيونات الكالسيوم التي أبلغ عنها Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في نفس المناطق ذات الاهتمام. كل أجهزة الاستشعار تقرير التذبذب مثل ارتفاع أيون الكالسيوم. وكلاهما يظهر نفس الوقت في اثنين من الخلايا الخمس التي تم فحصها.
ومع ذلك، فإن ارتفاعات أيونات الكالسيوم التي تظهرها Lck-RCaMP2 تبقى عند مستوى أعلى من OER-GCaMP6f في الخلايا الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن ارتفاع أيونات الكالسيوم يطول في محيط غشاء البلازما ، في حين يتم إنهاؤه في وقت سابق حول ER ، وهو مصدر هذه الإشارة أيون الكالسيوم الناجمة عن تحفيز الهستامين. إشارات أيونات الكالسيوم العفوية من الخلايا الفلكية في الثقافة المختلطة الخلايا العصبية الفلكية من فرس النهر والكورتيكات الفئران تظهر من قبل Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.
ارتفاعات أيونات الكالسيوم التلقائية مرئية فقط في العملية الفلكية، وليس في جسم الخلية الذي يتفق مع التقارير السابقة. وينظر إلى الارتفاعات التلقائية أيون الكالسيوم من قبل Lck-GCaMP6f في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران غير ناضجة في اثنين من هيرتز. وتشير الدورات الزمنية لخمس مناطق مختلفة ذات أهمية إلى أن هذه المرتفعات محصورة محلياً في المجالات الفرعية الخلوية.
الخلايا العصبية فرس النهر الماوس ناضجة المصابة مع OER-GCaMP6f-التعبير AAV النواقل تظهر استجابات أيون الكالسيوم استجابة لإضافة DHPG. بالنسبة لتصوير الكالسيوم، فإن قوة التهيّم هي العامل الأكثر أهمية. يرجى الحفاظ على ضوء الإثارة منخفضة قدر الإمكان لتجنب تبييض الصور وسامية الصورة.
مصدر إشارات الكالسيوم يمكن أن يؤكد كذلك من قبل Pomakorzi باستخدام مثبطات محددة للقنوات الكالسيوم. وكان فك رموز إشارات الكالسيوم لاستحضار مخرجات محددة مسألة بيولوجية أساسية. هذه تقنية تصوير الكالسيوم تمهد الطريق لوصف تنوع إشارات الكالسيوم داخل الخلوية.
