Вскрытие сигналов кальция в субклеточном разрешении является одним из наиболее важных шагов для расшифровки внутриклеточных сигналов кальция, определяющих выход биологического явления. Этот протокол описывает новый метод визуализации кальция, который позволяет контролировать тот самый момент притока кальция и высвобождения кальция. Этот протокол применим ко всем типам клеток, что позволяет выражение генетически закодированных показателей кальция.
Мы считаем, что наш метод может быть расширен до вскрытия сигналов кальция при субклеточном разрешении у живых животных в лабораторной культуре. Помочь продемонстрировать процедуру будет Мацуми Хиросе, техник из нашей лаборатории. Для начала этой процедуры поместите стеклянный покров диаметром 18 миллиметров в каждую колодец из 12 хорошо пластины.
Используйте стерилизованную воду и приготовьте 12,5 миллилитров раствора 0,4% PEI для каждой используемой пластины из 12. Добавьте один миллилитр решения PEI к каждой хорошо, и убедитесь, что есть нет пузырьков под крышкой скользит. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию.
На следующий день используйте аспиратор для удаления решения PEI. Добавьте один миллилитр стерилизованной воды к каждому хорошо и встряхните пластину так, чтобы раствор PEI между крышкой скольжения и пластины вымываются тщательно. Повторите этот процесс мытья два дополнительных раза со свежей стерилизованной водой.
После окончательной стирки, аспирировать воду из каждого хорошо полностью. Внутри капота используйте ультрафиолетовый свет, чтобы высушить и стерилизовать крышку скользит, по крайней мере 15 минут. Блюдо с покрытием PEI может храниться при четырех градусах цельсия в течение двух месяцев.
Когда готовы приступить, осветить посуду ультрафиолетовым светом в течение 15 минут, как раз перед использованием. Добавьте пять миллилитров стерильной дистиллированной воды в пространство между колодцами, чтобы предотвратить испарение среды культуры. Во-первых, мыть кортисы с инкубационный солевой раствор.
Затем инкубировать кортис с трипсином и ДНК в инкубационный солевой раствор в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию. Затем, мыть кортисы три раза с ледяной инкубации солевой раствор. Удалите супернатант и добавьте два миллилитров покрытия среднего, дополненного 150 микролитров акций DNAse I.
Отмежеваться от клеток, трубы двадцать раз или меньше, и фильтровать клетки через ситечко клетки с пор размером 70 микрометров. Затем вымойте клеточный ситечко 20 миллилитров среды покрытия. Для приготовления замороженного клеточного бульона промыть клетки 20 миллилитров среды для мытья.
Разбавить корковые клетки с покрытием среды до плотности 140 000 жизнеспособных клеток на миллилитр. Затем добавьте один миллилитр разбавленной клеточной подвески в крышку с покрытием PEI в 12 пластин культуры хорошо. Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа в течение двух-трех дней.
Когда клетки стабильны, через два-три дня после покрытия, изменить культуру среды на обслуживание среды. Для подготовки замороженных запасов клеток, спина вниз клетки, используя ротор качели центрифугировать клетки на 187 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант и добавить криоконсервации среды, хранится на четыре градуса по Цельсию, чтобы получить плотность клеток 10 миллионов клеток на миллилитр.
Aliquot один миллилитр клеточной подвески в криогенные трубки. Поместите трубки в контейнер для замораживания клеток со скоростью замерзания минус один градус по Цельсию в минуту, пока температура не будет достигнута до минус 80 градусов по Цельсию. Перенесите замораживающий контейнер в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Чтобы оживить замороженные клетки, предварительно разогреть средство мытья и среды обслуживания для замороженных корковых клеток. Далее, оттепель замороженных клеток быстро в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Разбавить клетки мягко с предварительно разогретой среды мытья и центрифуги с качели ротора в 187 раз G в течение трех минут.
Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр среды мытья и измеряйте жизнеспособную плотность клеток. Затем разбавьте клетки средой обслуживания замороженных корковых клеток, чтобы дать плотность клеток 300 000 клеток на миллилитр. Сейд один миллилитр этой клеточной подвески в колодцы PEI покрытием 12 пластин скважины.
Для трансфекции через три-восемь дней после покрытия, этикетка две трубки, одна для плазменной ДНК, а другой для реагента трансфекции. Добавьте 50 микролитров пониженной среды сыворотки на колодец, к каждой трубке. Добавьте 0,5 микрограмма плазменной ДНК на крышку скольжения и один микролитер дополнения сопровождается трансфекции реагент для нейронов, на хорошо плазменной трубки ДНК.
Для совместной трансфекции Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f смешайте 0,5 микрограмма каждой плазмиды и один микролитер дополнения в 50 микролитров пониженной среды сыворотки на колодец. Затем добавьте один микролитер трансфектного реагента на колодец в трансфектную трубку реагентов. Vortex обе трубки в течение одной-двух секунд.
Затем добавьте смесь трансфектного реагента в смесь ДНК. Аккуратно пипетку смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Загрузите эту смесь на клетки в капле мудрым образом.
Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода в течение двух-трех дней, пока маркер белков выражаются. Смешайте L и O, чтобы сделать инфекцию AAC. Добавьте три микролитров AAC на колодец к смешанной культуре нейронов-астроцитов.
Аккуратно качайте блюдо, чтобы смешать. Поддерживать культуру в течение одной-двух недель до тех пор, пока не будут выражены ГЭИ. Сначала смонтировать крышку скольжения, содержащие клетки трансфицированы с Lck-RCaMP2 и OER-CaMPG6f в камеру записи микроскопа.
Добавьте 400 микролитров носителя изображения и поместите крышку поверх камеры. Выберите набор фильтров для GCaMP6f и источника света. Найдите астроциты, выражаюющие OER-GCaMP6f.
Далее выберите набор фильтров и источник света для RCaMP2 и подтвердите, выражается ли Lck-RCaMP2 в тех же астроцитах. Запись промежуток времени изображения Lck-RCaMP2 на два Герц в течение двух минут и сохранить данные изображений. После этого измените набор фильтров обратно для GCaMP6f.
Запись промежуток времени изображения OER-GCaMP6f на два Герц в течение двух минут и сохранить данные изображений. В этом исследовании, Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f выражаются в клетках HeLa и оба сигнала были записаны одновременно с помощью оптики расщепления изображения, через 24 часа после трансфекции. При добавлении гистамина интенсивность сигнала Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f увеличилась.
Курсы времени высоты ионов кальция, о которые сообщают Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f, сравниваются в тех же областях, представляющих интерес. Оба датчика сообщают о колебаясь, как высота иона кальция. И оба показывают один и тот же курс времени в двух из пяти исследованных клеток.
Тем не менее, высота иона кальция, показанная Lck-RCaMP2, остается на более высоком уровне, чем OER-GCaMP6f в других клетках. Эти результаты показывают, что высота ионов кальция продлевается в непосредственной близости от плазменной мембраны, в то время как она прекращается ранее вокруг ER, который является источником этого ионового сигнала кальция, индуцированного стимуляцией гистамина. Спонтанные ионные сигналы кальция от астроцитов в смешанной культуре нейрон-астроцитов от крысиных гиппокампов и кортиков показаны Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f.
Спонтанные высоты ионов кальция видны только в астроцитическом процессе, а не в клеточном организме, что согласуется с предыдущими сообщениями. Спонтанные высоты ионов кальция Lck-GCaMP6f в незрелых нейронах крысиного гиппокампа видны в двух Герц. Курсы времени для пяти различных областей, представляющих интерес, свидетельствуют о том, что эти высоты локально ограничиваются субклеточных доменов.
Зрелые мыши гиппокампа нейронов, инфицированных OER-GCaMP6f-выражение AAV векторы показывают реакции ионов кальция в ответ на добавление DHPG. Для визуализации кальция, возбуждение люминации власти является наиболее важным фактором. Пожалуйста, держите свет возбуждения как можно более низким, чтобы избежать фото-отбеливания и фототоксичности.
Источник сигналов кальция может быть дополнительно подтвержден Pomakorzi с использованием конкретных ингибиторов кальциевых каналов. Декодирование сигналов кальция, чтобы вызвать определенный выход был фундаментальный биологический вопрос. Этот метод визуализации кальция прокладывает путь для описания разнообразия внутриклеточных сигналов кальция.
