Kalsiyum sinyallerinin hücre altı çözünürlükte diseksiyonu, çıkış biyolojik fenomenini belirleyen hücre içi kalsiyum sinyallerinin çözülmesi için en önemli adımlardan biridir. Bu protokol, kalsiyum akını ve kalsiyum salınımı anının izlenmesini sağlayan yeni bir kalsiyum görüntüleme yöntemini tanımlar. Bu protokol, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin ifade sini sağlayan tüm hücre tipleri için geçerlidir.
Yöntemimizin laboratuvar kültüründe yaşayan hayvanlarda hücre altı çözünürlüğünde kalsiyum sinyallerinin diseksiyonuna kadar genişletilme potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Matsumi Hirose, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, 12 kuyu plakasının her kuyunun içine 18 milimetre çapında cam kapak fişi yerleştirin.
Steril su kullanın ve kullanılan her 12 kuyu plakası için %0,4 PEI çözeltisi için 12,5 mililitre hazırlayın. Her kuyuya bir mililitre PEI çözeltisi ekleyin ve kapak fişlerinin altında kabarcık olmadığından emin olun. 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde gece boyunca kuluçkaya yat.
Ertesi gün, PEI çözeltisini çıkarmak için bir aspiratör kullanın. Her kuyuya bir mililitre steril su ekleyin ve plakayı sallayın, böylece kapak ve plaka arasındaki PEI çözeltisi iyice yıkanır. Bu yıkama işlemini taze sterilize su ile iki kez daha tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, her kuyudan tamamen su aspire. Kaputun içinde, kapak fişlerini en az 15 dakika boyunca kurutmak ve sterilize etmek için ultraviyole Bir ışık kullanın. PEI kaplı çanak iki aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir.
Devam etmeye hazır olduğunuzda, kullanımdan hemen önce, 15 dakika boyunca ultraviyole ışık ile yemekleri aydınlatın. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için kuyular arasındaki boşluğa beş mililitre steril distile su ekleyin. İlk olarak, inkübasyon tuzlu ile korteksleri yıkayın.
Daha sonra, 37 santigrat derece beş dakika kuluçka tuzlu Trypsin ve DNae ile korteksler inkübün. Daha sonra kortikülleri buz gibi kuluçka tuzlu suyla üç kez yıkayın. Supernatant çıkarın ve dnase I stok 150 mikrolitre ile takviye kaplama orta iki mililitre ekleyin.
Yirmi kez veya daha az boru lama hücreleri ayrıştırın ve 70 mikrometre gözenek boyutu ile bir hücre süzgeci ile hücreleri filtre. Daha sonra hücre süzgecini 20 mililitre kaplama aracıyla yıkayın. Dondurulmuş hücre stokunun hazırlanması için, yıkama ortamının 20 mililitre ile hücreleri yıkayın.
Mililitre başına 140 000 canlı hücre yoğunluğuna kaplama orta ile kortikal hücreleri seyreltin. Daha sonra, 12 kuyu kültür plakaları PEI kaplı kapak fişleri seyreltilmiş hücre süspansiyon bir mililitre ekleyin. Hücreleri karbondioksit kuvözde 37 derecede 2-3 gün saklar.
Hücreler kararlı olduğunda, kaplamadan 2-3 gün sonra, kültür ortamını bakım ortamına çevirin. Dondurulmuş hücre stokunun hazırlanması için, hücreleri üç dakika boyunca 187 kez G'de santrifüj etmek için bir salıncak rotoru kullanarak hücreyi aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspirate ve kriyopreservation orta ekleyin, dört santigrat derecede tutulan, mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğu elde etmek için.
Aliquot kriyojenik tüpler içine hücre süspansiyon bir mililitre. Tüpleri, eksi 80 santigrat derecelik bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar dakikada eksi bir santigrat derece donma hızına sahip bir hücre dondurma kabına yerleştirin. Dondurucu kabı eksi 80 derecede bir dondurucuya aktarın.
Dondurulmuş hücreleri canlandırmak için, önceden yıkama ortamı ve dondurulmuş kortikal hücreler için bakım ortamı ısıtın. Sonra, 37 santigrat derece bir su banyosunda hızla dondurulmuş hücreleri eritin. Hücreleri önceden ısıtılmış yıkama ortamı ve santrifüj ile 187 kez G'de üç dakika hafifçe seyreltin.
Bir mililitre yıkama ortamında peleti yeniden askıya alın ve canlı hücre yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, mililitre başına 300 000 hücre yoğunluğu verim, dondurulmuş kortikal hücreler için bakım ortamı ile hücreleri seyreltmek. PEI kaplı 12 kuyu plakaları kuyularına bu hücre süspansiyon bir mililitre cede.
Kaplamadan 3-8 gün sonra transfeksiyon için, biri plazma DNA'sı diğeri transfeksiyon reaktifi için olmak üzere iki tüp etiketleyin. Her tüpe her kuyu başına 50 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Kapak kayma başına plazma DNA 0.5 mikrogram ve nöronlar için transfeksiyon reaktif eşliğinde ek bir mikrolitre ekleyin, plazma DNA tüpü başına iyi başına.
Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f'ın eş transfeksiyonu için, her plazmidin 0,5 mikrogramını ve bir mikrolitre ekini 50 mikrolitrelik azaltılmış serum ortamını iyi karıştırın. Daha sonra, transfeksiyon reaktif tüpüne her kuyu başına bir mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Girdap her iki tüpü de bir iki saniyeliğine.
Sonra, DNA karışımına transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Yavaşça pipet karışımı ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bu karışımı damla gibi hücrelere yükleyin.
Marker proteinler ifade edilene kadar 2-3 gün boyunca karbondioksit inkübatör de kuluçka. AAC enfeksiyonu yapmak için L ve O'yu karıştırın. Karışık nöron-astrosit kültürüne her kuyu başına üç mikrolitre AAC ekleyin.
Yavaşça karıştırmak için çanak kaya. GECIs ifade edilene kadar bir ila iki hafta boyunca kültür devam ettirin. Lck-RCaMP2 ve OER-CaMPG6f ile transfected hücreleri içeren kapak fişini ilk olarak mikroskobun kayıt odasına monte edin.
Görüntüleme ortamının 400 mikrolitresini ekleyin ve odanın üzerine bir kapak yerleştirin. GCaMP6f ve ışık kaynağı için filtre kümesini seçin. OER-GCaMP6f ifade astrositleri bulun.
Ardından, RCaMP2 için bir filtre seti ve ışık kaynağı seçin ve Lck-RCaMP2'nin aynı astrositlerle ifade edilip edilmeyeceğini doğrulayın. Lck-RCaMP2'nin iki Hertz'de iki dakika boyunca zaman atlamalı görüntülerini kaydedin ve görüntüleme verilerini kaydedin. Bundan sonra, GCaMP6f için filtre kümesini bu şekilde değiştirin.
OER-GCaMP6f'ın zaman atlamalı görüntülerini iki dakikada iki Hertz'de kaydedin ve görüntüleme verilerini kaydedin. Bu çalışmada, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücrelerinde ifade edilmiş ve her iki sinyal transfeksiyondan 24 saat sonra görüntü bölme optikkullanılarak eş zamanlı olarak kaydedilmiştir. Histamin ilavesi üzerine, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyal yoğunluğu arttı.
Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından bildirilen kalsiyum iyon yüksekliği nin zaman kursları aynı ilgi bölgelerinde karşılaştırılmaktadır. Her iki sensör de salınım benzeri kalsiyum iyon yüksekliği rapor ediyor. Ve her ikisi de incelenen beş hücreden ikisinde aynı zaman rotasını gösteriyor.
Ancak, Lck-RCaMP2 tarafından gösterilen kalsiyum iyon yükseklikleri diğer hücrelerde OER-GCaMP6f daha yüksek düzeyde kalır. Bu sonuçlar, kalsiyum iyon yüksekliğinin plazma zarının çevresinde uzadığını, histamin stimülasyonunun neden olduğu bu kalsiyum iyon sinyalinin kaynağı olan ACIL'in çevresinde daha erken sonlandırıldığını göstermektedir. Sıçan hipokampi ve kortekslerden nöron-astrosit karışık kültür astrositlerden spontan kalsiyum iyon sinyalleri Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından gösterilmiştir.
Spontan kalsiyum iyon yükseklikleri sadece astrositik süreçte görülebilir, önceki raporlarla tutarlı olan hücre vücudunda değil. Olgunlaşmamış sıçan hipokampal nöronlarda Lck-GCaMP6f tarafından spontan kalsiyum iyon yükseklikleri iki Hertz görülür. Beş farklı ilgi alanının zaman kursları, bu yükselmelerin yerel olarak alt hücresel etki alanlarıyla sınırlı olduğunu göstermektedir.
OER-GCaMP6f ekspresyonu AAV vektörleri ile enfekte olgun fare hipokampal nöronlar DHPG eklenmesine yanıt olarak kalsiyum iyon yanıtları göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme için uyarma ışıklandırma gücü en kritik faktördür. Fotoğraf beyazlatma ve foto-toksisite önlemek için mümkün olduğunca düşük uyarma ışığı tutun.
Kalsiyum sinyallerinin kaynağı daha da Kalsiyum kanallarına özel inhibitörleri kullanılarak Pomakorzi tarafından teyit edilebilir. Belirli bir çıktı uyandırmak için kalsiyum sinyalleri decoding temel bir biyolojik soru olmuştur. Bu kalsiyum görüntüleme tekniği hücre içi kalsiyum sinyallerinin çeşitliliğini tanımlamanın yolunu açar.
