הניתוח של אותות סידן ברזולוציה תת-תאית, הוא אחד הצעדים החשובים ביותר לפענוח אותות סידן תוך-תאיים הקובעים את התופעה הביולוגית של התפוקה. פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה חדשה של סידן המאפשרת ניטור של הרגע עצמו של זרם הסידן ושחרור הסידן. פרוטוקול זה ישים על כל סוגי התאים המאפשר ביטוי של מחווני סידן מקודדים גנטית.
אנו מאמינים כי לשיטה שלנו יש פוטנציאל להתרחב לניתוס אותות סידן ברזולוציה התת-תאית בבעלי חיים חיים בתרבות המעבדה. עוזר להדגים את ההליך יהיה Matsumi Hirose, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים 18 מילימטר קוטר כיסוי זכוכית להחליק בכל באר של צלחת 12 היטב.
השתמש במים מעוקרים, והכן 12.5 מיליליטר של פתרון 0.4%PEI עבור כל צלחת באר 12 בשימוש. הוסף מיליליטר אחד של פתרון PEI לכל באר, ולהבטיח כי אין בועות מתחת לתעודות הכיסוי. דגירה במשך הלילה באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, השתמש בשואפתן כדי להסיר את פתרון PEI. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מעוקרים לכל באר ומנערים את הצלחת כך שתסתדר PEI בין החלקת הכיסוי לצלחת נשטף ביסודיות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות עם מים מעוקרים טריים.
לאחר הכביסה הסופית, שאפו את המים מכל באר לחלוטין. בתוך מכסה המנוע, השתמש באור אולטרה סגול לייבוש ועיקור החלקות הכיסוי למשך 15 דקות לפחות. ניתן לאחסן את המנה מצופה ה-PEI בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים.
כאשר מוכנים להמשיך, להאיר את הכלים עם אור אולטרה סגול במשך 15 דקות, ממש לפני השימוש. מוסיפים חמישה מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים בחלל שבין בארות כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות. ראשית, לשטוף את קליפת המוח עם מלוחים דגירה.
לאחר מכן, דגירה קליפת המוח עם טריפסין ו DNAse מלוחים דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את קליפת המוח שלוש פעמים עם קרח קר דגירה מלוחים. הסר את supernatant ולהוסיף שני מיליליטר של ציפוי בינוני בתוספת 150 microliters של מלאי DNAse I.
נתק את התאים על ידי צינור עשרים פעמים או פחות ולסנן את התאים דרך מסננת תאים עם גודל נקבובית של 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לשטוף את מסננת התא עם 20 מיליליטר של המדיום ציפוי. להכנת מלאי תאים קפואים, לשטוף את התאים עם 20 מיליליטר של מדיום לשטוף.
לדלל את התאים קליפת המוח עם ציפוי בינוני לצפיפות של 140 000 תאים קיימא למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של ההשעיה תא מדולל להחליקים כיסוי מצופה PEI ב 12 צלחות תרבות היטב. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים.
כאשר התאים יציבים, יומיים עד שלושה ימים לאחר ציפוי, לשנות את מדיום התרבות למדיום התחזוקה. להכנת מלאי תאים קפואים, לסובב את התא, באמצעות רוטור נדנדה כדי צנטריפוגה התאים ב 187 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את העל-טבעי והוסיפו את מדיום ההקפאה, שנשמר בארבע מעלות צלזיוס, כדי להשיג צפיפות תאים של 10 מיליון תאים למיליליטר.
Aliquot מיליליטר אחד של ההשעיה התא לתוך צינורות קריוגניים. מניחים את הצינורות לתוך מיכל הקפאת תא עם קצב הקפאה של מינוס מעלות צלזיוס לדקה, עד טמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס הוא הגיע. מעבירים את מיכל ההקפאה למקפיא במינוס 80 מעלות.
כדי להחיות את התאים הקפואים, מחממים מראש את מדיום הכביסה ואת מדיום התחזוקה לתאי קליפת המוח הקפואים. לאחר מכן, להפשיר את התאים הקפואים במהירות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. מדללים את התאים בעדינות עם מדיום שטיפה מחומם מראש צנטריפוגה עם רוטור נדנדה ב 187 פעמים G במשך שלוש דקות.
להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום לשטוף ולמדוד את צפיפות התא קיימא. לאחר מכן, לדלל את התאים עם אמצעי התחזוקה עבור תאים קליפת המוח קפואים, כדי להניב צפיפות תאים של 300 000 תאים למיליליטר. לוותר על מיליליטר אחד של ההשעיה התא הזה לתוך הבארים של PEI מצופה 12 צלחות היטב.
עבור transfection שלושה עד שמונה ימים לאחר ציפוי, תווית שני צינורות, אחד עבור DNA פלזמה והשני עבור reagent transfection. הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת לכל באר, לכל צינור. הוסף 0.5 מיקרוגרם של DNA פלזמה לכל להחליק כיסוי אחד microliter של תוספת מלווה reagent transfection עבור נוירונים, לגם לצינור DNA פלזמה.
עבור שיתוף transfection של Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f, לערבב 0.5 מיקרוגרם של כל פלסמיד מיקרוליטר אחד של תוספת ב 50 microliters של מדיום סרום מופחת לגם. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של רגנט transfection לכל באר לצינור reagent transfection. וורטקס שני הצינורות למשך דקה עד שתי שניות.
לאחר מכן, מוסיפים את תערובת רגנט transfection לתערובת ה-DNA. בעדינות פיפטה לערבב ולטגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לטעון את התערובת על התאים בצורה טיפה חכם.
אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים עד חלבוני הסמן באים לידי ביטוי. מערבבים L ו- O כדי להפוך את זיהום AAC. הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של AAC ל באר לתרבות הנוירונים-אסטרוציטים המעורבת.
בעדינות רוק המנה לערבב. לשמור על התרבות במשך שבוע עד שבועיים עד GECIs באים לידי ביטוי. תחילה לטעון את החלקת המכסה המכילה את התאים מתחלף עם Lck-RCaMP2 ו OER-CaMPG6f לתוך תא ההקלטה של המיקרוסקופ.
מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה ומ מניחים מכסה על גבי התא. בחר את ערכת המסננים עבור GCaMP6f ואת מקור האור. אתר את האסטרוציטים המבטעים את OER-GCaMP6f.
לאחר מכן, בחר ערכת מסננים ומקור אור עבור RCaMP2 ואשר אם Lck-RCaMP2 מבוטא באותם אסטרוציטים. הקלט תמונות של Lck-RCaMP2 בשתי הרץ במשך שתי דקות ושמור את נתוני ההדמיה. לאחר מכן, שנה את ערכת המסנן בחזרה לזה עבור GCaMP6f.
הקלט תמונות של OER-GCaMP6f בשתי הרץ במשך שתי דקות ושמור את נתוני ההדמיה. במחקר זה, Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f באים לידי ביטוי בתאי HeLa ושני האותות נרשמו בו זמנית באמצעות אופטיקה פיצול תמונה, 24 שעות לאחר transfection. עם התוספת של היסטמין, עוצמת האות של Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f גדל.
קורסי הזמן של גובה יון סידן שדווחו על ידי Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f מושווים באותם אזורים של עניין. שני החיישנים מדווחים על העלאת יון סידן דמוית תנודות. ושניהם מראים את אותו מסלול זמן בשניים מחמשת התאים שנבדקו.
עם זאת, גובה יון הסידן המוצג על ידי Lck-RCaMP2 נשאר ברמה גבוהה יותר מאשר OER-GCaMP6f בתאים האחרים. תוצאות אלה מצביעות על כך שהתרוממות יון הסידן ממושכת בקרבת קרום הפלזמה, בעוד שהוא הסתיים מוקדם יותר סביב ה- ER, שהוא המקור לאות יון סידן זה המושרה על ידי גירוי היסטמין. אותות יון סידן ספונטניים של אסטרוציטים בתרבות המעורבת של נוירון-אסטרוציטים מהיפוקמפוס חולדה וקליפת המוח מוצגים על ידי Lck-RCaMP2 ו- OER-GCaMP6f.
גובה יוני סידן ספונטני נראה רק בתהליך האסטרוציטי, לא בגוף התא אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים. גובה יוני סידן ספונטני על ידי Lck-GCaMP6f בנוירונים לא בוגרים של ההיפוקמפוס החולדות נראה בשני הרץ. מסלולי הזמן לחמישה תחומי עניין שונים מצביעים על כך שגבהים אלה מוגבלים באופן מקומי לתחומים התת-תאיים.
נוירונים היפוקמפוס עכבר בוגר נגוע OER-GCaMP6f ביטוי וקטורים AAV להראות תגובות יון סידן בתגובה לתוספת של DHPG. עבור דימות סידן, כוח ההזרעה של העירור הוא הגורם הקריטי ביותר. אנא שמרו על אור העירור נמוך ככל האפשר, כדי למנוע הלבנת תמונות ורעילות בצילום.
מקור אותות הסידן יכול להיות מאושר עוד יותר על ידי Pomakorzi באמצעות מעכבים ספציפיים לערוצי סידן. פענוח אותות סידן כדי לעורר תפוקה ספציפית כבר שאלה ביולוגית בסיסית. טכניקת הדמיית סידן זו סוללת את הדרך לתאר את המגוון של אותות סידן תוך-תאיים.
