세포 내 분해능에서 칼슘 신호의 해부는 생체 학적 현상을 결정하는 세포 내 칼슘 신호를 해독하기 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜은 칼슘 유입 과 칼슘 방출의 바로 그 순간의 모니터링을 가능하게 하는 새로운 칼슘 화상 진찰 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표의 발현을 허용하는 모든 세포 유형에 적용됩니다.
우리는 우리의 방법이 실험실 문화에 있는 살아있는 동물에 있는 세포 분해능에 칼슘 신호의 해부로 확장될 가능성이 있다는 것을 믿습니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이 되는 것은 실험실의 기술자인 히로즈 마쓰미입니다. 이 절차를 시작하려면 12 웰 플레이트의 각 웰에 18 밀리미터 직경유리 커버 슬립을 놓습니다.
살균된 물을 사용하고 사용 중인 12개의 웰 플레이트당 0.4%의 PEI 용액을 12.5밀리리터를 준비합니다. PEI 솔루션 의 밀리리터 를 각 웰에 추가하고 커버 전표 아래에 거품이 없는지 확인합니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 밤동안 37도의 인큐베이터에 배양하십시오.
다음 날, PEI 솔루션을 제거하기 위해 흡인기를 사용합니다. 각 우물에 살균 된 물 1 밀리리터를 추가하고 덮개 슬립과 플레이트 사이의 PEI 용액이 철저히 씻겨 되도록 접시를 흔들어줍니다. 이 세척 과정을 신선한 살균 물로 2회 추가로 반복하십시오.
마지막 세척 후, 완전히 각 에서 물을 흡인. 후드 내부에는 자외선을 사용하여 뚜껑 전표를 15분 이상 건조하고 살균합니다. PEI 코팅 요리는 최대 2개월 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다.
진행 준비를 마쳤을 때, 사용하기 직전에 자외선으로 요리를 15분 동안 조명하십시오. 배양 배지의 증발을 방지하기 위해 우물 사이의 공간에 멸균 증류수 5밀리리터를 첨가합니다. 먼저, 인큐베이션 식염수로 코르티스를 씻으시다.
그런 다음 트립신과 DNAse로 코르티치를 37도에서 5분간 인큐베이션 식염수로 배양합니다. 그런 다음, 얼음 차가운 인큐베이션 식염수로 코르티스를 세 번 씻는다. 상체를 제거하고 DNAse I 재고의 150 마이크로 리터로 보충 도금 매체의 두 밀리리터를 추가합니다.
20배 이하의 파이프를 통해 세포를 해리시키고 70마이크로미터의 모공 크기로 세포 여과기를 통해 세포를 필터링한다. 다음으로, 도금 매체의 20 밀리리터로 셀 스트레이너를 씻는다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 세척 매체의 20 밀리리터로 세포를 씻으라.
밀리리터 당 140 000 실행 가능한 세포의 밀도로 도금 매체로 피질 세포를 희석시. 이어서, 12개의 웰 배양 판에 PEI 코팅 커버 슬립에 희석셀 현탁액1밀리리터를 첨가한다. 2 ~3 일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 유지하십시오.
세포가 안정되면, 도금 후 2~3일, 배양 배지를 유지보수 매체로 변경한다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 3 분 동안 187 배 G에서 세포를 원심 분리하는 스윙 로터를 사용하여 셀아래로 회전하십시오. 상체를 흡인하고 냉동 보존 배지를 추가하여 섭씨 4도에 보관하여 밀리리터당 1,000만 개의 세포 밀도를 얻습니다.
극저온 튜브에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 알리쿼트. 영하 80도의 온도에 도달 할 때까지, 분당 영하 1도의 동결 속도와 셀 동결 용기에 튜브를 배치합니다. 냉동 용기는 영하 80도에서 냉동고로 옮춥습니다.
냉동 된 세포를 부활하려면, 냉동 피질 셀에 대한 세척 매체및 유지 보수 매체를 미리 따뜻하게. 다음으로, 냉동 된 세포를 37섭씨에서 수조에서 빠르게 해동하십시오. 3분 동안 187회 G의 스윙 로터로 미리 데워진 세척 매체와 원심분리기로 세포를 부드럽게 희석시.
세척 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 실행 가능한 세포 밀도를 측정합니다. 이어서, 냉동 피질 세포에 대한 유지 보수 배지로 세포를 희석하고, 밀리리터당 300 000 세포의 세포 밀도를 산출한다. PEI 코팅 12 웰 플레이트의 우물에이 세포 현탁액의 Cede 1 밀리리터.
도금 후 3~8일 간 트랜스펙트의 경우, 플라즈마 DNA용, 다른 하나는 형질 검사 시약용 2개의 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 튜브에 잘 당 50 마이크로 리터의 감소 된 혈청 배지를 추가합니다. 커버 슬립 당 혈장 DNA의 0.5 마이크로 그램과 뉴런에 대한 트랜스펙트 시약을 동반 보충의 마이크로 리터, 플라즈마 DNA 튜브에 잘 당 추가합니다.
Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 공동 변환을 위해 각 플라스미드의 0.5 마이크로그램과 1마이크로리터의 보충제를 잘 당 50 마이크로리터에 섞는다. 다음으로, 경질 시약 튜브에 잘 당 형질 전환 시약의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1~2초 동안 두 튜브를 소용돌이시다.
그런 다음, DNA 혼합물에 경전 시약 혼합물을 추가한다. 부드럽게 파이펫을 사용하여 실온에서 5분간 혼합하고 배양합니다. 이 혼합물을 드롭-현명한 방식으로 셀에 적재합니다.
마커 단백질이 발현될 때까지 2~3일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다. AAC 감염을 만들기 위해 L과 O를 혼합합니다. 혼합 된 신경 성상세포 문화에 잘 당 AAC의 3 개의 마이크로 리터를 추가합니다.
부드럽게 혼합 접시를 흔들어. GECI가 표현될 때까지 1~2주 동안 문화를 유지한다. 먼저 Lck-RCaMP2 및 OER-CaMPG6f로 감염된 세포를 포함하는 커버 슬립을 현미경의 기록 챔버에 장착합니다.
이미징 배지의 마이크로리터 400기를 추가하고 챔버 위에 뚜껑을 놓습니다. GCaMP6f 및 광원에 대한 필터 세트를 선택합니다. OER-GCaMP6f를 표현하는 성상세포를 찾습니다.
다음으로 RCaMP2의 필터 세트 및 광원을 선택하고 Lck-RCaMP2가 동일한 성상세포로 표현되는지 확인합니다. 2분 동안 두 Hertz에서 Lck-RCaMP2의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 그런 다음 GCaMP6f의 필터 집합을 다시 변경합니다.
2분 동안 두 Hertz에서 OER-GCaMP6f의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 이 연구에서는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f가 HeLa 세포에서 발현되며 두 신호모두 회전 후 24시간 광학을 분할하는 영상을 사용하여 동시에 기록되었다. 히스타민이 추가되면서 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도가 증가했습니다.
Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 보고된 칼슘 이온 고도의 시간 과정은 관심의 동일 지구에서 비교됩니다. 두 센서 모두 진동과 같은 칼슘 이온 고도를 보고합니다. 그리고 둘 다 검사된 5개의 세포의 2에서 동일 시간 과정을 보여줍니다.
그러나, Lck-RCaMP2에 의해 표시된 칼슘 이온 고도는 그밖 세포에 있는 OER-GCaMP6f 보다는 더 높은 수준에 남아 있습니다. 이러한 결과는 혈장 막 부근에서 칼슘 이온 고도가 연장되어 히스타민 자극에 의해 유도된 이 칼슘 이온 신호의 근원인 ER 주위에서 일찍 종료된다는 것을 나타낸다. 쥐 해마와 코르티체에서 뉴런 성상세포 혼합 배양에서 성상세포에서 자발적인 칼슘 이온 신호는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 표시됩니다.
자발적인 칼슘 이온 고도는 이전 보고서와 일치하는 세포 본체가 아닌 성상세포 공정에서만 볼 수 있습니다. 미성숙한 쥐 해마 뉴런에서 Lck-GCaMP6f에 의한 자발적인 칼슘 이온 고도는 두 헤르츠에서 볼 수 있습니다. 관심 있는 5개 영역의 시간 과정은 이러한 고도가 로컬로 셀룰러 하위 도메인에 국한되어 있음을 시사합니다.
OER-GCaMP6f 발현 AAV 벡터에 감염된 성숙한 마우스 해마 뉴런은 DHPG의 첨가에 응하여 칼슘 이온 반응을 나타낸다. 칼슘 이미징의 경우, 흥분 발광 력이 가장 중요한 요소입니다. 사진 표백및 사진 독성을 피하기 위해 흥분빛을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
칼슘 신호의 근원은 칼슘 채널에 특정 억제제를 사용하여 Pomakorzi에 의해 추가로 확인될 수 있습니다. 특정 출력을 연상시키는 칼슘 신호를 해독하는 것은 근본적인 생물학적 질문이었습니다. 이 칼슘 이미징 기술은 세포 내 칼슘 신호의 다양성을 설명하는 길을 열어줍니다.
