La dissezione dei segnali di calcio a risoluzione subcellulare, è uno dei passaggi più importanti per decodificare i segnali di calcio intracellulare che determinano il fenomeno biologico di uscita. Questo protocollo descrive un nuovo metodo di imaging del calcio che consente il monitoraggio del momento stesso dell'afflusso di calcio e del rilascio di calcio. Questo protocollo è applicabile a tutti i tipi di cellule che consentono l'espressione di indicatori di calcio geneticamente codificati.
Crediamo che il nostro metodo abbia il potenziale per essere esteso alla dissezione dei segnali di calcio alla risoluzione subcellulare negli animali viventi nella cultura di laboratorio. A dimostrare la procedura sarà Matsumi Hirose, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, posizionare lo scivolo di copertura in vetro di 18 millimetri di diametro in ogni pozzo di una piastra di 12 potta.
Utilizzare acqua sterilizzata e preparare 12,5 millilitri di una soluzione 0,4%PEI per ogni piastra da 12 porvili utilizzata. Aggiungere un millilitro della soluzione PEI a ciascun pozzo e assicurarsi che non ci siano bolle sotto i coperchi. Incubare durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, utilizzare un aspiratore per rimuovere la soluzione PEI. Aggiungere un millilitro di acqua sterilizzata ad ogni pozzo e agitare la piastra in modo che la soluzione PEI tra lo scivolamento del coperchio e la piastra sia lavata accuratamente. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte con acqua fresca sterilizzata.
Dopo il lavaggio finale, aspirare completamente l'acqua da ogni pozzo. All'interno del cappuccio, utilizzare una luce ultravioletta per asciugare e sterilizzare i coperchi scivola per almeno 15 minuti. Il piatto rivestito in PEI può essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di due mesi.
Quando sei pronto a procedere, illumina i piatti con la luce ultravioletta per 15 minuti, poco prima dell'uso. Aggiungere cinque millilitri di acqua distillata sterile nello spazio tra i pozzi per evitare l'evaporazione del mezzo di coltura. In primo luogo, lavare i cortici con incubazione salina.
Quindi, incubare i cortici con tripside e DNAsi in incubazione salina per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare i cortici tre volte con l'incubazione ghiacciata salina. Rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri di mezzo di placcatura integrati con 150 microlitri di materiale DNASI I.
Dissociare le cellule tubazioni venti volte o meno e filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 micrometri. Quindi, lavare il filtro cellulare con 20 millilitri del mezzo di placcatura. Per la preparazione del calcio cellulare congelato, lavare le cellule con 20 millilitri del mezzo di lavaggio.
Diluire le cellule corticali con un mezzo di placcatura ad una densità di 140 000 cellule vitali per millilitro. Quindi, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita ai coperchi rivestiti in PEI nelle piastre di coltura di 12 pozzi. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per due o tre giorni.
Quando le celle sono stabili, da due a tre giorni dopo la placcatura, cambiare il mezzo di coltura nel mezzo di manutenzione. Per la preparazione del calcio cellulare congelato, girare verso il basso la cella, usando un rotore oscillante per centrifugare le cellule a 187 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante e aggiungere il mezzo di crioconservazione, mantenuto a quattro gradi Celsius, per ottenere una densità cellulare di 10 milioni di cellule per millilitro.
Aliquota un millilitro della sospensione cellulare in tubi criogenici. Posizionare i tubi in un contenitore di congelamento cellulare con un tasso di congelamento di meno un grado Celsius al minuto, fino a raggiungere una temperatura di meno 80 gradi Celsius. Trasferire il contenitore di congelamento in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Per ravvivare le cellule congelate, pre-riscaldare il mezzo di lavaggio e il mezzo di mantenimento per le cellule corticali congelate. Successivamente, scongelare rapidamente le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Diluire delicatamente le cellule con mezzo di lavaggio pre-riscaldato e centrifugare con un rotore oscillante a 187 volte G per tre minuti.
Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di mezzo di lavaggio e misurare la densità cellulare praticabile. Quindi, diluire le cellule con il mezzo di mantenimento per le cellule corticali congelate, per produrre una densità cellulare di 300 000 cellule per millilitro. Cedere un millilitro di questa sospensione cellulare nei pozzi delle piastre a 12 pozzi rivestite in PEI.
Per la trasfezione da tre a otto giorni dopo la placcatura, etichettare due tubi, uno per il DNA plasmatico e l'altro per il reagente di trasfezione. Aggiungere 50 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo, ad ogni tubo. Aggiungere 0,5 microgrammi di DNA plasmatico per slittamento di copertura e un microlitro di integratore accompagnato da reagente di trasfezione per neuroni, per pozzo al tubo del DNA plasmatico.
Per la co-trasfezione di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, mescolare 0,5 microgrammi di ogni plasmide e un microlitro di integratore in 50 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo. Quindi, aggiungere un microlitro di reagente di trasfezione per pozzo al tubo del reagente di trasfezione. Vortice entrambi i tubi per uno o due secondi.
Quindi, aggiungere la miscela di reagente di trasfezione alla miscela di DNA. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Caricare questa miscela sulle cellule in modo drop-wise.
Incubare in un incubatore di anidride carbonica per due o tre giorni fino a quando le proteine marcatori sono espresse. Mescolare L e O per fare l'infezione da AAC. Aggiungere tre microlitri di AAC per pozzo alla coltura mista neurone-astrocita.
Dondolare delicatamente il piatto per mescolare. Mantenere la cultura per una o due settimane fino a quando non vengono espressi i GECI. Per prima cosa montare il coperchio contenente le celle trasfette con Lck-RCaMP2 e OER-CaMPG6f nella camera di registrazione del microscopio.
Aggiungere 400 microlitri del mezzo di imaging e posizionare un coperchio sopra la camera. Scegliere il set di filtri per GCaMP6f e la sorgente luminosa. Individuare gli astrociti che esprimono OER-GCaMP6f.
Scegliere quindi un set di filtri e una sorgente luminosa per RCaMP2 e verificare se Lck-RCaMP2 è espresso negli stessi astrociti. Registrare le immagini time lapse di Lck-RCaMP2 in due Hertz per due minuti e salvare i dati di imaging. Successivamente, modificare il filtro impostato su quello per GCaMP6f.
Registrare le immagini time lapse di OER-GCaMP6f a due Hertz per due minuti e salvare i dati di imaging. In questo studio, Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sono espressi in celle HeLa ed entrambi i segnali sono stati registrati simultaneamente utilizzando ottiche di divisione delle immagini, 24 ore dopo la trasfezione. Con l'aggiunta di Istamina, l'intensità del segnale di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f aumentò.
I corsi di tempo di elevazione degli ioni di calcio riportati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f vengono confrontati nelle stesse regioni di interesse. Entrambi i sensori riportano un'elevazione degli ioni di calcio simile a un'oscillazione. Ed entrambi mostrano lo stesso corso di tempo in due delle cinque cellule esaminate.
Tuttavia, le elevazioni degli ioni di calcio mostrate da Lck-RCaMP2 rimangono al livello più alto di OER-GCaMP6f nelle altre cellule. Questi risultati indicano che l'elevazione degli ioni di calcio è prolungata in prossimità della membrana plasmatica, mentre viene terminata prima intorno al ER, che è la fonte di questo segnale ionico di calcio indotto dalla stimolazione dell'istamina. I segnali spontanei di ioni di calcio dagli astrociti nella coltura mista neuronale-astrocita da ippocampi e cortici di ratto sono mostrati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f.
Le elevazioni spontanee degli ioni di calcio sono visibili solo al processo astrocitico, non al corpo cellulare che è coerente con i rapporti precedenti. Le elevazioni spontanee degli ioni di calcio da parte di Lck-GCaMP6f nei neuroni immaturi dell'ippocampale del ratto sono viste in due Hertz. I corsi di tempo per cinque diverse regioni di interesse suggeriscono che queste elevazioni sono localmente limitate ai domini subcellulari.
I neuroni ippocampali del topo maturi infettati da vettori AAV di espressione OER-GCaMP6f mostrano risposte agli ioni di calcio in risposta all'aggiunta di DHPG. Per l'imaging del calcio, il potere di luminazione dell'eccitazione è il fattore più critico. Si prega di mantenere la luce di eccitazione il più bassa possibile per evitare lo sbiancamento fotografico e la fototossicità.
La fonte dei segnali di calcio può essere ulteriormente confermata da Pomakorzi usando inibitori specifici per canali di calcio. Decodificare i segnali di calcio per evocare un'uscita specifica è stata una questione biologica fondamentale. Questa tecnica di imaging del calcio apre la strada a descrivere la diversità dei segnali di calcio intracellulare.
