A dissecção de sinais de cálcio em uma resolução subcelular, é um dos passos mais importantes para a decodificação de sinais intracelulares de cálcio que determinam o fenômeno biológico da saída. Este protocolo descreve um novo método de imagem de cálcio que permite o monitoramento do momento do influxo de cálcio e liberação de cálcio. Este protocolo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de indicadores de cálcio geneticamente codificados.
Acreditamos que nosso método tem potencial para ser expandido para a dissecção de sinais de cálcio na resolução subcelular em animais vivos na cultura de laboratório. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Matsumi Hirose, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque uma tampa de vidro de 18 milímetros de diâmetro em cada poço de uma placa de 12 poços.
Use água esterilizada e prepare 12,5 mililitros de uma solução PEI de 0,4% para cada placa de poço que está sendo utilizada. Adicione um mililitro da solução PEI a cada poço e certifique-se de que não há bolhas por baixo dos deslizamentos de cobertura. Incubar durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, use um aspirador para remover a solução PEI. Adicione um mililitro de água esterilizada em cada poço e agite a placa para que a solução PEI entre o deslizamento da tampa e a placa seja completamente lavada. Repita este processo de lavagem duas vezes adicionais com água esterilizada fresca.
Após a lavagem final, aspire a água de cada poço completamente. Dentro do capô, use uma luz ultravioleta para secar e esterilizar os deslizamentos de cobertura por pelo menos 15 minutos. O prato revestido pei pode ser armazenado a quatro graus Celsius por até dois meses.
Quando estiver pronto para prosseguir, ilumine os pratos com a luz ultravioleta por 15 minutos, pouco antes de usar. Adicione cinco mililitros de água destilada estéril no espaço entre os poços para evitar a evaporação do meio cultural. Primeiro, lave os cortices com soro fisiológico de incubação.
Em seguida, incubar os cortices com Trypsin e DNAse em soro fisiológico de incubação por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os cortices três vezes com soro fisiológico de incubação gelada. Remova o supernatante e adicione dois mililitros de meio de revestimento suplementados com 150 microliters de estoque DNAse I.
Dissociar as células por pipetação vinte vezes ou menos e filtrar as células através de um coador de células com um tamanho de poro de 70 micrômetros. Em seguida, lave o coador de células com 20 mililitros do meio de revestimento. Para a preparação do caldo celular congelado, lave as células com 20 mililitros do meio de lavagem.
Diluir as células corticais com o meio de chapeamento a uma densidade de 140 000 células viáveis por mililitro. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular diluída aos deslizamentos de tampa revestidos pei nas 12 placas de cultura de poço. Mantenha as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por dois a três dias.
Quando as células estiverem estáveis, dois a três dias após o revestimento, mude o meio de cultura para o meio de manutenção. Para a preparação do caldo celular congelado, gire pela célula, usando um rotor de balanço para centrifugar as células a 187 vezes G por três minutos. Aspire o supernasce e adicione o meio criopreservador, mantido a quatro graus Celsius, para obter uma densidade celular de 10 milhões de células por mililitro.
Alíquota de um mililitro da suspensão celular em tubos criogênicos. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento celular com uma taxa de congelamento de menos um grau Celsius por minuto, até que uma temperatura de menos 80 graus Celsius seja atingida. Transfira o recipiente de congelamento para um congelador a menos 80 graus Celsius.
Para reviver as células congeladas, pré-aqueça o meio de lavagem e o meio de manutenção para células corticais congeladas. Em seguida, descongele as células congeladas rapidamente em um banho de água a 37 graus Celsius. Diluir as células suavemente com meio de lavagem pré-aquecido e centrífuga com um rotor de balanço a 187 vezes G por três minutos.
Suspenda a pelota em um mililitro de meio de lavagem e meça a densidade celular viável. Em seguida, diluir as células com o meio de manutenção para células corticais congeladas, para produzir uma densidade celular de 300 000 células por mililitro. Ceda um mililitro desta suspensão celular nos poços do PEI revestido 12 placas de poço.
Para transfecção de três a oito dias após o revestimento, rotule dois tubos, um para DNA de plasma e outro para o reagente de transfecção. Adicione 50 microliters de meio soro reduzido por poço, a cada tubo. Adicione 0,5 microgramas de DNA plasmá plasma por deslizamento de cobertura e um microliter de suplemento acompanhado de reagente de transfecção para neurônios, por bem ao tubo de DNA plasmá plasma.
Para a co-transfecção de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, misture 0,5 microgramas de cada plasmídeo e um microlitr de suplemento em 50 microliters de meio soro reduzido por poço. Em seguida, adicione um microliter de reagente de transfecção por poço ao tubo de reagente de transfecção. Vórtice ambos os tubos por um a dois segundos.
Em seguida, adicione a mistura de reagente de transfecção à mistura de DNA. Pipeta suavemente para misturar e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque essa mistura nas células de uma maneira que caia.
Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono por dois a três dias até que as proteínas marcadoras sejam expressas. Misture L e O para fazer a infecção aac. Adicione três microliters de AAC por poço à cultura neurônio-astrócito mista.
Balance suavemente o prato para misturar. Mantenha a cultura por uma a duas semanas até que os GECIs sejam expressos. Primeiro monte o deslizamento de cobertura contendo as células transfeinadas com Lck-RCaMP2 e OER-CaMPG6f na câmara de gravação do microscópio.
Adicione 400 microliters do meio de imagem e coloque uma tampa em cima da câmara. Escolha o conjunto de filtros para GCaMP6f e a fonte de luz. Localize os astrócitos expressando OER-GCaMP6f.
Em seguida, escolha um conjunto de filtro e fonte de luz para RCaMP2 e confirme se Lck-RCaMP2 é expresso nos mesmos astrócitos. Registo de tempo de Lck-RCaMP2 em dois Hertz por dois minutos e salve os dados de imagem. Depois disso, altere o filtro para o GCaMP6f.
Registo de tempo de OER-GCaMP6f em dois Hertz por dois minutos e salve os dados de imagem. Neste estudo, Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f são expressos em células HeLa e ambos os sinais foram registrados simultaneamente usando óptica de divisão de imagem, 24 horas após a transfecção. Após a adição de Histamina, a intensidade do sinal de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f aumentou.
Os cursos de tempo de elevação da íon de cálcio relatados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f são comparados nas mesmas regiões de interesse. Ambos os sensores relatam uma elevação de íons de cálcio semelhante à oscilação. E ambos mostram o mesmo curso de tempo em duas das cinco células examinadas.
No entanto, as elevações de íons de cálcio mostradas por Lck-RCaMP2 permanecem no nível mais alto do que OER-GCaMP6f nas outras células. Estes resultados indicam que a elevação da íon de cálcio é prolongada nas proximidades da membrana plasmática, enquanto é interrompida mais cedo em torno do ER, que é a fonte deste sinal de íon de cálcio induzido pela estimulação de histamina. Sinais espontâneos de íons de cálcio de astrócitos na cultura mista neurônio-astrócito de hipocampi de ratos e cortices são mostrados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f.
Elevações espontâneas de íons de cálcio são visíveis apenas no processo astrócito, não no corpo celular que é consistente com relatórios anteriores. Elevações espontâneas de íons de cálcio por Lck-GCaMP6f em neurônios hipocampais de ratos imaturos são vistas em dois Hertz. Os cursos de tempo para cinco regiões de interesse diferentes sugerem que essas elevações estão localmente confinadas aos domínios subcelulares.
Neurônios hipocampais de camundongos maduros infectados com vetores AAV de expressão OER-GCaMP6f mostram respostas de íons de cálcio em resposta à adição de DHPG. Para a imagem de cálcio, o poder de luminação excitação é o fator mais crítico. Por favor, mantenha a luz de excitação o mais baixa possível para evitar o branqueamento de fotos e foto-toxicidade.
A fonte dos sinais de cálcio pode ser confirmada por Pomakorzi usando inibidores específicos para canais de cálcio. A decodificação de sinais de cálcio para evocar saída específica tem sido uma questão biológica fundamental. Esta técnica de imagem de cálcio abre caminho para descrever a diversidade de sinais intracelulares de cálcio.
