البروتوكول الذي نقدمه هنا هو موصل شبه سريع ومنخفض التكلفة ، وأساليب قائمة على التسلسل لفحص الأنوبلويد في الأجنة. البروتوكول المكرر لتنفيذ تضخيم القالب ، وترتيبات مكتبة التسلسل يجعل الكشف PGTA استنساخها ، والإنتاجية العالية ، وفعالة من حيث التكلفة وتوفير الوقت. وقت تشغيل هذا المنظم شبه موصل هو فقط من ساعتين إلى أربع ساعات.
تقصير وقت التحول من تلقي العينات إلى إصدار التقارير إلى خمسة أيام. توفر هذه الطريقة تسلسل الجينوم لفحص aneuploidy ، نسخ عدد الاختلاف ، ومكالمات متعددة الأشكال النيوكليوتيد واحد. ونظراً لتسلسل الكيمياء المختلفة، لا يمكن ترتيب المكتبة التي أعدها هذا البروتوكول مباشرة على أنظمة التسلسل الأخرى.
ولكن نفس المنظم، ولكن إعداد مكتبة مختلفة، وأنها قادرة على القيام غير الغازية فحص ما قبل الولادة. يدل الإجراء على أن شيانغتشون قوه، وهو فني من مختبرنا. للبدء في التسلسل، دوامة كل مكتبة مخففة وتدور لفترة وجيزة أربع مرات على جهاز الطرد المركزي المصغر لمدة ثلاث ثوان في كل مرة.
ثم، تأخذ خمسة ميكرولترات من كل مكتبة، إلى تجمع في النواة خالية، نقطة واحدة أنبوب خمسة ملليلتر. دوامة المكتبة المختلطة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة ثلاث ثوان. إضافة 150 ميكرولترات من حل كسر، إلى اثنين من أنابيب الانتعاش الجديدة.
تثبيت أنابيب الانتعاش الجديدة، وجهاز التوجيه الانتعاش ولوحة التضخيم. مزيج عن طريق عكس زجاجة الزيت ثلاث مرات. تأكد من أن كلا من النفط والانتعاش حل لا يقل عن ثلثي كامل.
دوامة العازلة PCR مزيج الرئيسي لمدة 30 ثانية وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة ثلاث ثوان. دوامة الجسيمات الكرة والمكتبة المختلطة لمدة دقيقة واحدة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة ثلاث ثوان. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج الربط 2400 microliter ، عن طريق إضافة 172 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى ، وثمانية ميكرولترات من المكتبة المختلطة ، و 120 ميكرولترات من مزيج انزيم ، و 100 ميكرولترات من جزيئات الكرة ، إلى الأنبوب الذي يحتوي على 2000 ميكرولترات من العازلة PCR مزيج رئيسي.
تعيين ماصة إلى 800 ميكروليتر وتحميل مزيج الربط إلى عامل تصفية رد فعل من خلال منفذ العينة. عكس زجاجة الزيت ثلاث مرات واستخدام ماصة P1000 لإضافة 200 ميكرولترات من زيت رد الفعل إلى مرشح التفاعل. حدد البرنامج بروتون ثم حدد الزر المساعد، للتأكد من أن الجهاز قد تم إعداده بشكل صحيح، باتباع الإرشادات الموجودة على الشاشة.
ثم انقر فوق التالي لبدء تشغيل البرنامج. تحميل 100 ميكرولترات من عينة المنتج PCR مستحلب، 130 ميكرولترات من الخرز غسلها، 300 ميكرولترات من محلول غسل ES، و 300 ميكرولترات من محلول الذوبان في قطاع أنبوب ثمانية. ضع شريط الأنبوب الثمانية على نظام التخصيب.
تثبيت تلميح ماصة ونقطة الصفر أنبوب ميليلتر جديد وبدء البرنامج. جهاز طرد مركزي أنبوب صفر نقطة مليلتر في 15، 500 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل المُتَجَرّر، والاحتفاظ بعشرة ميكرولترات من منتج التخصيب.
أضف 200 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى إلى الأنبوب واخلطها عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي صفر نقطة اثنين ملليلتر أنبوب مرة أخرى. تجاهل المُتَجَرّر والاحتفاظ بـ 10 ميكرولترات من منتج التخصيب.
إضافة 90 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى إلى الأنبوب واخلط عن طريق الدوامة. لتحضير القالب، قم بتدوين التحكم الإيجابي و دورانه لفترة وجيزة. إضافة خمسة ميكرولترات من السيطرة الإيجابية إلى 100 ميكرولترات من المنتج التخصيب.
دوامة و جهاز طرد مركزي في 15،500 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant والحفاظ على 10 ميكروليتر من القالب. بعد ذلك، إضافة 20 ميكرولترات من التمهيدي تسلسل، و 15 ميكرولتررس من العازلة الصلب إلى أنبوب القالب.
دوامة الأنبوب وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة ثلاث ثوان. احتضان الأنبوب في دورة حرارية مع غطاء ساخن. ثم إضافة 10 ميكروليتر من المخزن المؤقت التحميل إلى الأنبوب.
مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. خلط 55 ميكرولترات من العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتحميل العينة إلى تحميل جيدا من رقاقة. الحفاظ على تلميح الماصة المستخدمة ونقطة الصفر اثنين من المليلتر PCR أنبوب.
ضع الرقاقة على جهاز الطرد المركزي الصغير رقاقة عندما تدخل عينة رقاقة. تحقق من الموقع والطرد المركزي رقاقة لمدة 10 دقيقة. إعداد 50٪ عازلة التليد عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من العازلة الصلب و 500 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى في نقطة واحدة أنبوب خمسة ملليلتر.
إعداد حل التنظيف، عن طريق إضافة 500 ميكرولتررس من العازلة الصلب و 500 ميكرولترات من 100٪ 2-propanol في نقطة واحدة أنبوب خمسة ملليلتر. ثم، وإعداد خليط رغوة، عن طريق إضافة 49 ميكرولترات من العازلة 50٪، وميكرلتر واحد من حل رغوة إلى اثنين جديد نقطة واحدة خمسة أنابيب ملليلتر. هواء الماصات في واحدة من مخاليط الرغوة، وتحميل 120 ميكرولترات من فقاعات في التحميل جيدا.
نقل السائل المطرود المفرط من الخارج بشكل جيد إلى بئر التحميل، والطرد المركزي رقاقة لمدة 30 ثانية على جهاز الطرد المركزي رقاقة صغيرة. كرر العملية لخليط رغوة الثاني. إضافة 55 ميكرولترات من 50٪ عازلة الضم إلى أبقى عند نقطة الصفر اثنين من المليلتر أنبوب.
استخدام ماصة أبقى تلميح إلى ماص صعودا وهبوطا. تحميل جميع ميكرولتررس 55 من العازلة التول على التحميل جيدا. جهاز طرد مركزي رقاقة لمدة 30 ثانية على جهاز الطرد المركزي رقاقة صغيرة المعينة.
تحميل 100 ميكرولترات من محلول التنظيف في رقاقة تحميل جيدا والتخلص من السائل المطرود من الخارج جيدا. كرر خطوة التحميل هذه مرة واحدة. تحميل 100 ميكرولترات من 50٪ من العازلة الصلب، في رقاقة تحميل جيدا.
كرر هذه الخطوة التحميل لإجمالي ثلاث مرات. إضافة 60 ميكرولتررس من 50٪ العازلة الضم وستة ميكرولتررس من الانزيم التسلسل في أنبوب جديد نقطة واحدة خمسة ملليلتر. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
ببطء ماصة 65 ميكرولترات من هذا الحل المختلط في رقاقة تحميل جيدا، وتجنب فقاعات. حافظ على الرقاقة بعيدًا عن الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وأخيراً، بعد الحضانة، على الفور تحميل رقاقة على المنظم وانقر فوق تشغيل تسلسل تشغيل على الشاشة لبدء التسلسل.
وأسفر تحليل إحصائي استعادي عن مرحلة الانقسام 186 و1135 جنيناً من الأجنة في مرحلة الكيسات الأرمائية عن معدلات نجاح أكثر من 95٪ من معدل نجاح WGA في كلا النوعين من العينات. وكانت معدلات فشل مراقبة الجودة التسلسل 3.4٪ في مجموعة المرحلة الانقسام وفقط 1.9٪ في مجموعة المرحلة blastocyst. بجانب aneuploidy، يمكن استخدام بيانات التسلسل لتحليل آخر.
على سبيل المثال، نسخ الاختلافات رقم مع حجم أقل من خمسة ميغا قاعدة، أو تحليل الحمض النووي mycondrial، اعتمادا على عمق التسلسل والجودة. مع تحسن في عدد النسخ الدعوة، يمكن للباحثين مواصلة التحقيق في مستقبل الفسيفساء الكروموسومية في الأجنة المرحلة المبكرة من الإنسان.
