Burada sunduğumuz protokol, embriyolarda aneuploidin taranması için hızlı ve düşük maliyetli yarı iletken, sıralama tabanlı yöntemlerdir. Şablon amplifikasyonu gerçekleştirmek için geliştirilmiş protokol ve sıralama kitaplığı düzenlemeleri PGTA algılamayı yeniden dönüştürülebilir, yüksek iş elde etme, maliyet etkin ve zaman tasarrufu sağlar. Bu yarı iletken sıralayıcının çalışma süresi sadece 2-4 saattir.
Örneklerin alınmasından rapor verme süresinin beş güne çıkarılması. Bu yöntem aneuploigrafi taraması, kopya numarası değişimi ve tek nükleotit polimorfizm aramaları için genom dizilimi sağlar. Farklı sıralama kimyası nedeniyle, bu protokol tarafından hazırlanan kütüphane doğrudan diğer sıralama sistemlerinde sıralanamaz.
Ama aynı sıralayıcı, ama farklı kütüphane hazırlık, non invaziv prenatal tarama yapmak için yeteneğine sahiptir. Prosedürü gösteren Xiangchun Guo, laboratuarımızdan bir teknisyen olacak. Sıralamaya başlamak için, girdap her seyreltilmiş kütüphane ve kısaca üç saniye her zaman için mini santrifüj üzerinde dört kez spin.
Sonra, her kütüphanenin beş mikrolitre almak, çekirdeksiz içine havuz, bir nokta beş mililitre tüp. Girdap karışık kütüphane ve kısaca üç saniye için bir mini santrifüj üzerinde spin. İki yeni kurtarma tüpüne 150 mikrolitre kırma çözeltisi ekleyin.
Yeni kurtarma tüplerini, kurtarma yönlendiricisini ve amplifikasyon plakasını töyikurun. Yağ şişesini üç kez ters çevirerek karıştırın. Hem yağ hem de geri kazanım çözeltisinin en az üçte ikisinin dolu olduğundan emin olun.
Vortex ana karışımı PCR tampon 30 saniye ve kısaca üç saniye için bir mini santrifüj üzerinde spin. Girdap küre parçacıkları ve bir dakika için karışık kütüphane ve kısaca üç saniye için bir mini santrifüj üzerinde spin. Daha sonra, 172 mikrolitre nükleaz içermeyen su, karışık kütüphanenin sekiz mikrolitresi, enzim karışımının 120 mikrolitresi ve küre parçacıklarının 100 mikrolitresini ana karışım PCR tamponunun 2000 mikrolitresini içeren tüpe ekleyerek 2400 mikrolitrelik bir ligasyon karışımı hazırlayın.
Bir pipeti 800 mikrolitreye ayarlayın ve ligasyon karışımını numune portundan reaksiyon filtresine yükleyin. Yağ şişesini üç kez ters çevirin ve reaksiyon filtresine 200 mikrolitre reaksiyon yağı eklemek için P1000 pipeti kullanın. Program Proton'u seçin ve monitördeki talimatları izleyerek aygıtın doğru şekilde ayarlandığından emin olmak için destekli düğmeyi seçin.
Ardından programı başlatmak için İleri'yi tıklatın. Emülsiyon PCR ürün numunesinin 100 mikrolitresini, yıkanmış boncukların 130 mikrolitresini, ES yıkama çözeltisinin 300 mikrolitresini ve erime çözeltisinin 300 mikrolitresini sekiz tüp şeridine yükleyin. Zenginleştirme sistemi üzerine sekiz tüp şerit yerleştirin.
Bir pipet ucu ve yeni bir sıfır noktası iki mililitretüp yükleyin ve programı başlatın. Sıfır noktası iki mililitrelik tüpü 15, 500 kez G'yi beş dakika lığına santrifüj edin. Supernatant atın ve zenginleştirme ürünü on mikrolitre tutun.
Tüpe 200 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve girdap ile karıştırın. Sıfır noktası iki mililitrelik tüpü tekrar santrifüj edin. Supernatant atın ve zenginleştirme ürünü 10 mikrolitre tutun.
Tüpe 90 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve girdap ile karıştırın. Şablonu hazırlamak için, pozitif kontrolü girdap ve kısa bir süre spin. Zenginleştirme ürününün 100 mikrolitresine beş mikrolitre pozitif kontrol ekleyin.
Girdap ve santrifüj 15, 500 kez G beş dakika. Supernatant atın ve şablonun 10 mikrolitre tutun. Ardından, şablon tüpüne sıralama astarının 20 mikrolitresini ve 15 mikrolitre annealing arabelleği ekleyin.
Tüp girdap ve kısa bir süre üç saniye için bir mini santrifüj üzerinde spin. Tüpü ısıtılmış kapaklı bir termal döngüiçinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra tüpyükleme tampon 10 mikrolitre ekleyin.
Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın. 55 mikrolitre numuneyi yukarı ve aşağı borularla karıştırın ve numuneyi çipin yükleme kuyusuna yükleyin. Kullanılan pipet ucunu ve sıfır noktası iki mililitre PCR tüp tutun.
Bazı numune çipe girdiğinde çipi mini santrifüjün üzerine yerleştirin. Pozisyonunu kontrol edin ve çipi 10 dakika santrifüj edin. Bir nokta beş mililitrelik tüp içine 500 mikrolitre tavustampon ve 500 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek %50 annealing tamponu hazırlayın.
Bir nokta beş mililitrelik tüp içine 500 mikrolitre annealing tampon ve % 100 2-propanol 500 mikrolitre ekleyerek, yıkama çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, iki yeni bir nokta beş mililitre tüpler için% 50 annealing tampon ve köpük çözeltisi bir mikrolitre 49 mikrolitre ekleyerek, köpük karışımı hazırlayın. Pipet havaköpük karışımlarından birine, ve yükleme kuyusu içine kabarcıklar 120 mikrolitre yükleyin.
Aşırı çıkarılan sıvıyı çıkış kuyusu yükleme kuyuya aktarın ve çipi mini santrifüjüzerinde 30 saniye santrifüj edin. İkinci köpük karışımı için işlemi tekrarlayın. Sıfır noktasında tutulan iki mililitrelik tüp e%50'lik tamponun 55 mikrolitresini ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı için tutulan pipet ucunu kullanın. Ekleyici tamponun 55 mikrolitresinin tümlerini yükleme kuyuya yükleyin. Belirlenen çip mini santrifüj üzerinde 30 saniye boyunca çip santrifüj.
Yıkama çözeltisinin 100 mikrolitresini iyi yüklenen yongaya yükleyin ve çıkarılan sıvıyı çıkış kuyunundan atın. Bu yükleme adımLarını bir kez tekrarlayın. %50'lik tamponun 100 mikrolitresini talaş yükleme kuyuya yükleyin.
Bu yükleme adımını toplam üç kez tekrarlayın. Yeni bir nokta beş mililitre tüp içine% 50 annealing tampon ve sıralama enzimaltı mikrolitre 60 mikrolitre ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.
Yavaş yavaş pipet 65 mikrolitre bu karışık çözeltiyi yongaya iyi yükleyerek kabarcıklardan kaçınArak. Çipi ışıktan uzak tutun ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Son olarak, kuluçkadan sonra, fişi hemen sıralayıcıya yükleyin ve sıralamaya başlamak için ekranda Sıralama Çalıştır'ı başlat'ı tıklatın.
186 dekolte evresi ve 1135 blastosist evre embriyoları üzerinde retrospektif istatistiksel analiz her iki tip örnekte de %95'in üzerinde WGA başarı oranı ile sonuçlandı. Sıralama kalite kontrol başarısızlık oranları dekolte evre grubunda %3.4, blastosist evre grubunda ise sadece %1.9 idi. Aneuploidi yanında, sıralama verileri diğer analizler için kullanılabilir.
Örneğin, sıralama derinliğine ve kalitesine bağlı olarak, beş megabazdan daha küçük bir boyuta veya mycondrial DNA analizine sahip kopya numarası varyasyonları. Kopya numarası aramasındaki iyileşme ile araştırmacılar, insan erken evre embriyolarında kromozommozizmin geleceğini daha da araştırabilirler.
