Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist ein schnelles und kostengünstiges Halbleiter-, Sequenzierungs-basierte Methoden zum Screening von Aneuploidie in Embryonen. Das verfeinerte Protokoll für die Durchführung der Vorlagenverstärkung und die Anordnung der Sequenzierungsbibliothek machen die PGTA-Erkennung reproduzierbar, hoher Durchsatz, kosteneffizient und zeitsparend. Die Laufzeit dieses Halbleiter-Sequenzers beträgt nur zwei bis vier Stunden.
Verkürzung der Bearbeitungszeit vom Eingehen von Stichproben bis zur Ausgabe von Berichten auf fünf Tage. Diese Methode bietet Genomsequenzierung für Aneuploidie-Screening, Kopiernummernvariation und einzelne Nukleotid-Polymorphismus-Aufrufe. Aufgrund unterschiedlicher Sequenzierungschemie kann die durch dieses Protokoll erstellte Bibliothek nicht direkt auf anderen Sequenzierungssystemen sequenziert werden.
Aber der gleiche Sequenzer, aber unterschiedliche Bibliothek Vorbereitung, ist es in der Lage, nicht-invasive pränatale Screening zu tun. Demonstriert wird das Verfahren von Xiangchun Guo, einem Techniker aus unserem Labor. Um mit der Sequenzierung zu beginnen, wirbeln Sie jede verdünnte Bibliothek und drehen Sie jeweils dreimal dreimal auf der Minizentrifuge für drei Sekunden.
Nehmen Sie dann fünf Mikroliter jeder Bibliothek, um in den Kern frei, ein Punkt fünf Milliliter Rohr zu bündeln. Wirbeln Sie die gemischte Bibliothek und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden. Fügen Sie 150 Mikroliter der Bruchlösung zu zwei neuen Rückgewinnungsrohren hinzu.
Installieren Sie die neuen Bergungsrohre, den Recovery-Router und die Verstärkerplatte. Mischen Sie die Ölflasche dreimal. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Öl- als auch die Rückgewinnungslösung mindestens zwei Drittel voll sind.
Den Master-Mix-PCR-Puffer für 30 Sekunden und kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden drehen. Wirbeln Sie die Kugelteilchen und die gemischte Bibliothek für eine Minute und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden. Als nächstes bereiten Sie eine 2400 Mikroliter Ligationsmischung vor, indem Sie 172 Mikroliter Nuklease-freies Wasser, acht Mikroliter der gemischten Bibliothek, 120 Mikroliter des Enzymmixes und 100 Mikroliter der Kugelpartikel in die Röhre mit 2000 Mikroliter des Master-Mix-PCR-Puffers einfügen.
Stellen Sie eine Pipette auf 800 Mikroliter ein und laden Sie die Ligationsmischung über den Probenanschluss in den Reaktionsfilter. Invertieren Sie die Ölflasche dreimal und verwenden Sie eine P1000 Pipette, um dem Reaktionsfilter 200 Mikroliter des Reaktionsöls hinzuzufügen. Wählen Sie das Programm Proton und dann die unterstützte Taste, um sicherzustellen, dass das Gerät richtig eingerichtet wurde, indem Sie den Anweisungen auf dem Monitor folgen.
Klicken Sie dann auf Weiter, um das Programm zu starten. 100 Mikroliter der Emulsions-PCR-Produktprobe, 130 Mikroliter der gewaschenen Perlen, 300 Mikroliter der ES-Waschlösung und 300 Mikroliter der Schmelzlösung in den acht Rohrstreifen laden. Legen Sie den acht Rohrstreifen auf das Anreicherungssystem.
Installieren Sie eine Pipette-Spitze und eine neue Nullpunkt-Zwei-Milliliter-Rohr und starten Sie das Programm. Zentrifugieren Sie den Nullpunkt zwei Milliliter Rohr bei 15, 500 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie zehn Mikroliter des Anreicherungsprodukts auf.
200 Mikroliter Nukleasefreies Wasser in die Röhre geben und durch Wirbeln mischen. Zentrifugieren Sie den Nullpunkt zwei Milliliter Rohr wieder. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 Mikroliter des Anreicherungsprodukts auf.
90 Mikroliter Nukleasefreies Wasser in die Röhre geben und durch Wirbeln mischen. Um die Vorlage vorzubereiten, wirbeln Sie die positiv-steuerende Steuerung und drehen Sie kurz. Fügen Sie fünf Mikroliter der Positivkontrolle zu 100 Mikroliter des Anreicherungsprodukts hinzu.
Wirbel und Zentrifuge bei 15, 500 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 Mikroliter der Schablone auf. Fügen Sie als Nächstes 20 Mikroliter der Sequenzierungsgrundierung und 15 Mikroliter des Glühpuffers zum Schablonenrohr hinzu.
Wirbeln Sie das Rohr und drehen Sie kurz auf einer Mini-Zentrifuge für drei Sekunden. Inkubieren Sie das Rohr in einem thermischen Cycler mit einem beheizten Deckel. Dann fügen Sie 10 Mikroliter des Ladepuffers in das Rohr.
Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Mischen Sie die 55 Mikroliter der Probe, indem Sie nach oben und unten pfeifen und laden Sie die Probe auf die Ladebohrung des Chips. Bewahren Sie die verwendete Pipettenspitze und den Nullpunkt zwei Milliliter PCR-Rohr.
Legen Sie den Chip auf die Chip-Minizentrifuge, wenn eine Probe in den Chip eindringt. Überprüfen Sie die Position und zentrifugieren Sie den Chip für 10 Minuten. Bereiten Sie 50% Glühpuffer vor, indem Sie 500 Mikroliter Glühpuffer und 500 Mikroliter Nuklease-freies Wasser in ein ein Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr geben.
Bereiten Sie die Spüllösung vor, indem Sie 500 Mikroliter Glühpuffer und 500 Mikroliter 100%2-Propanol in ein ein Punkt fünf Milliliter Rohr. Dann bereiten Sie die Schaummischung vor, indem Sie 49 Mikroliter des 50%glühenden Puffers und einen Mikroliter der Schäumlösung zu zwei neuen ein Punkt-Fünf-Milliliter-Röhren hinzufügen. Rohrluft in eine der schäumenden Mischungen und 120 Mikroliter der Blasen in den Ladebrunnen laden.
Übertragen Sie die übermäßig ausgestoßene Flüssigkeit aus dem Ausgang gut auf den Ladebrunnen, und zentrifugieren Sie den Chip für 30 Sekunden auf dem Chip Mini Zentrifuge. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Schaummischung. Fügen Sie 55 Mikroliter des 50%glühenden Puffers in die am Nullpunkt gehaltene Zwei-Milliliter-Röhre.
Verwenden Sie die gehaltene Pipettenspitze, um Pipette nach oben und unten zu pipette. Laden Sie alle 55 Mikroliter des Glühpuffers auf den Ladebrunnen. Zentrifugieren Sie den Chip für 30 Sekunden auf der dafür vorgesehenen Chip-Minizentrifuge.
100 Mikroliter der Spüllösung in den Spanladebrunnen laden und die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem Austrittsbrunnen entsorgen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt einmal. 100 Mikroliter des 50%glühenden Puffers in den Spanladebrunnen laden.
Wiederholen Sie diesen Ladeschritt insgesamt dreimal. Fügen Sie 60 Mikroliter des 50%glühenden Puffers und sechs Mikroliter des Sequenzierungsenzyms in eine neue fünf Milliliter-Röhre ein. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
Langsam Pipette 65 Mikroliter dieser gemischten Lösung in den Chip-Ladegut, Vermeidung von Blasen. Halten Sie den Chip von Licht fern und brüten Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Schließlich, nach der Inkubation, laden Sie den Chip sofort auf den Sequenzer und klicken Sie auf die Sequenzierung auf dem Bildschirm starten, um die Sequenzierung zu starten.
Eine retrospektive statistische Analyse von 186 Spaltstadium und 1135 Blastozysten-Stadium-Embryonen ergab über 95% WGA-Erfolgsraten in beiden Probentypen. Die Fehlerquote der Sequenzierung der Qualitätskontrolle betrug 3,4 % in der Spaltungsphase und nur 1,9 % in der Blastozysten-Stufengruppe. Neben der Aneuploidie können die Sequenzierungsdaten für andere Analysen verwendet werden.
Kopieren Sie z. B. Zahlenvariationen mit einer Größe von weniger als fünf Megabasen oder mykondriale DNA-Analysen, abhängig von der Sequenzierungstiefe und -qualität. Mit der Verbesserung der Copy Number Calling können Forscher die Zukunft des chromosomalen Mosaikismus in menschlichen Embryos im Frühstadium weiter untersuchen.
