Протокол, который мы представляем здесь, представляет такие быстрые и недорогие полупроводниковые методы, основанные на секвенировании для скрининга анеуплоидии в эмбрионах. Уточненный протокол для усиления шаблонов и механизмы секвенирования библиотеки делают обнаружение PGTA воспроизводимым, высокой пропускной способностью, экономически эффективным и экономящим время. Время работы этого полупроводникового секвенсора составляет всего два-четыре часа.
Сокращение времени оборота от получения образцов до выдачи отчетов на пять дней. Этот метод обеспечивает секвенирование генома для скрининга аневплоидии, вариации числа копий и одноклеотидных полиморфизмов. Из-за различной химии секвенирования библиотека, подготовленная этим протоколом, не может быть секвенирована непосредственно на других системах секвенирования.
Но тот же секвенсор, но другой библиотечный препарат, способен делать неинвазивный пренатальный скрининг. Демонстрацией процедуры будет Сянчунь Го, техник из нашей лаборатории. Чтобы начать секвенирование, вихрь каждой разбавленной библиотеки и кратко спина четыре раза на мини-центрифуги в течение трех секунд каждый раз.
Затем возьмите пять микролитров каждой библиотеки, чтобы объединиться в ядро, свободной, одна точка пять миллилитров трубки. Vortex смешанной библиотеки и кратко спина на мини-центрифуги в течение трех секунд. Добавьте 150 микролитров ломая разрешение, к 2 новым пробкам восстановления.
Установите новые восстановительные трубки, маршрутизатор восстановления и пластину усиления. Смешайте путем инвертирования бутылки масла три раза. Убедитесь, что как нефть, так и и аварийное решение заполнены по крайней мере на две трети.
Vortex мастер смешивать ПЦР буфер в течение 30 секунд и кратко спина на мини-центрифуги в течение трех секунд. Вихрь частиц сферы и смешанной библиотеки в течение одной минуты и кратко спина на мини центрифуге в течение трех секунд. Далее подготовьте смесь перевязки микролитров 2400 микролитров, добавив 172 микролитров нуклеазной воды, восемь микролитров смешанной библиотеки, 120 микролитров ферментной смеси и 100 микролитров частиц сферы в трубку, содержащую 2000 микролитров буфера ПЦР.
Установите пипетку до 800 микролитров и загрузите смесь перевязки на фильтр реакции через порт образца. Инвертировать бутылку масла три раза и использовать P1000 пипетки, чтобы добавить 200 микролитров реакционной масла в реакционной фильтр. Выберите программу "Протон", а затем выберите кнопку помощи, чтобы убедиться, что устройство было настроено правильно, следуя инструкциям на мониторе.
Затем нажмите Далее, чтобы начать программу. Загрузите 100 микролитров образца эмульсии ПЦР, 130 микролитров промытых бусин, 300 микролитров раствора для мытья ES и 300 микролитров раствора расплава в восьмитрубную полосу. Поместите восьмитрубную полосу на систему обогащения.
Установите наконечник пипетки и новую нулевую точку две миллилитровые трубки и запустите программу. Центрифуга нулевой точки две миллилитровые трубки на 15, 500 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и храните десять микролитров продукта обогащения.
Добавьте в трубку 200 микролитров воды без нуклеазы и перемешайте вихрем. Центрифуга нулевой точки две миллилитровые трубки снова. Откажитесь от супернатанта и храните 10 микролитров продукта обогащения.
Добавьте в трубку 90 микролитров воды без нуклеазы и перемешайте вихрем. Чтобы подготовить шаблон, вихрь положительный контроль и спина кратко. Добавьте пять микролитров положительного контроля в 100 микролитров обогатительного продукта.
Вихрь и центрифуга при 15 500 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и храните 10 микролитров шаблона. Затем добавьте 20 микролитров грунтовки секвенирования и 15 микролитров буфера анеаляля в трубку шаблона.
Вихрь трубки и кратко спина на мини-центрифуги в течение трех секунд. Инкубировать трубку в тепловой циклер с нагретой крышкой. Затем добавьте в трубку 10 микролитров погрузочного буфера.
Смешайте по трубе вверх и вниз. Смешайте 55 микролитров образца, трубя вверх и вниз, и загрузите образец на загружаемую колодец чипа. Держите использованный наконечник пипетки и нулевую точку два миллилитров ПЦР трубки.
Поместите чип на чип мини центрифуги, когда какой-то образец ввести чип. Проверьте положение и центрифуга чип в течение 10 минут. Подготовь 50%-ный буфер, добавив 500 микролитров буфера анеаля и 500 микролитров воды без нуклеазы в одну точку пятими миллилитровую трубку.
Подготовь решение для промывки, добавив 500 микролитров буфера аннелирования и 500 микролитров 100%2-пропанола в одну точку пятими миллилитровую трубку. Затем подготовь пенясь смесь, добавив 49 микролитров 50%-ного буфера и один микролитр пеняного раствора к двум новым пятимилитровым трубам. Пипетка воздуха в одну из пеняющихся смесей, и загрузить 120 микролитров пузырьков в погрузку хорошо.
Перенесите изливную вылежтую жидкость из выхода хорошо на погрузочную колодец, и центрифуга чипа в течение 30 секунд на чип мини центрифуге. Повторите процесс для второй вспенивания смеси. Добавьте 55 микролитров 50%-ного буфера в сохраненную в нулевой точке две миллилитровые трубки.
Используйте хранится пипетка отзыв пипетки вверх и вниз. Загрузите все 55 микролитров буфера для загрузки. Центрифуга чипа в течение 30 секунд на назначенном чипе мини-центрифуги.
Загрузите 100 микролитров раствора для промывки в хорошо загружаемый чип и выбросьте выброшенную жидкость из выхода хорошо. Повторите этот шаг загрузки один раз. Загрузите 100 микролитров 50%-ного буфера, в хорошую загрузку чипа.
Повторите этот шаг загрузки в общей сложности три раза. Добавьте 60 микролитров 50%-ного буфера и шесть микролитров фермента секвенирования в новую пятими миллилитровую трубку. Смешайте по трубе вверх и вниз.
Медленно пипетка 65 микролитров этого смешанного раствора в чип загрузки хорошо, избегая пузырьков. Держите чип подальше от света и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Наконец, после инкубации немедленно загрузите чип на секвенсор и нажмите Кнопку «Начать секвенирование» на экране, чтобы начать секвенирование.
Ретроспективный статистический анализ 186 стадии расщепления и 1135 эмбрионов стадии бластоцист привели к более чем 95%WGA успеха в обоих типах образцов. Секвенирование контроля качества отказов были 3,4% в группе стадии расщепления и только 1,9% в группе стадии бластоцист. Помимо анеуплоидии, данные секвенирования могут быть использованы для другого анализа.
Например, вариации числа копий размером менее пяти мегабазы, или анализ ДНК, в зависимости от глубины и качества секвенирования. С улучшением вызова номера копии, исследователи могут дополнительно исследовать будущее хромосомного мозаичности в эмбрионах ранней стадии человека.
