El protocolo que presentamos aquí es un semiconductor rápido y de bajo costo, métodos basados en la secuenciación para el cribado de la aneuploidía en embriones. El protocolo refinado para realizar la amplificación de plantillas y los arreglos de la biblioteca de secuenciación hacen que la detección de PGTA sea reproducible, de alto rendimiento, rentable y ahorro de tiempo. El tiempo de ejecución de este secuenciador de semiconductores es de sólo dos a cuatro horas.
Acortar el tiempo de respuesta desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes en cinco días. Este método proporciona secuenciación del genoma para el cribado de aneuploidía, la variación del número de copia y las llamadas de polimorfismo de nucleótido único. Debido a la química de secuenciación diferente, la biblioteca preparada por este protocolo no se puede secuenciar directamente en otros sistemas de secuenciación.
Pero el mismo secuenciador, pero diferente preparación de la biblioteca, es capaz de hacer cribado prenatal no invasivo. Demostrando el procedimiento estará Xiangchun Guo, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar la secuenciación, el vórtice cada biblioteca diluida y girar brevemente cuatro veces en la mini centrífuga durante tres segundos cada vez.
Luego, tome cinco microlitros de cada biblioteca, para agrupar en el tubo sin núcleo, un punto cinco mililitros. Vórtice la biblioteca mixta y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Añadir 150 microlitros de la solución de rotura, a dos nuevos tubos de recuperación.
Instale los nuevos tubos de recuperación, el router de recuperación y la placa de amplificación. Mezclar invirtiendo la botella de aceite tres veces. Asegúrese de que tanto el aceite como la solución de recuperación estén al menos dos tercios llenos.
Vortex el búfer PCR de mezcla maestra durante 30 segundos y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Vórtice las partículas de la esfera y la biblioteca mixta durante un minuto y girar brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. A continuación, prepare una mezcla de ligadura de 2400 microlitros, añadiendo 172 microlitros de agua libre de nucleasas, ocho microlitros de la biblioteca mixta, 120 microlitros de la mezcla enzimática y 100 microlitros de las partículas de la esfera, al tubo que contiene 2000 microlitros del búfer PCR de mezcla maestra.
Establezca una pipeta en 800 microlitros y cargue la mezcla de ligadura en el filtro de reacción a través del puerto de muestra. Invierta la botella de aceite tres veces y utilice una pipeta P1000 para añadir 200 microlitros del aceite de reacción al filtro de reacción. Seleccione el programa Protón y, a continuación, seleccione el botón asistido, para asegurarse de que el dispositivo se ha configurado correctamente, siguiendo las instrucciones del monitor.
A continuación, haga clic en Siguiente para iniciar el programa. Cargue 100 microlitros de la muestra del producto PCR de emulsión, 130 microlitros de las perlas lavadas, 300 microlitros de la solución de lavado ES y 300 microlitros de la solución de fusión en la tira de ocho tubos. Coloque la tira de ocho tubos en el sistema de enriquecimiento.
Instale una punta de pipeta y un nuevo tubo de dos mililitros de punto cero e inicie el programa. Centrifugar el tubo de dos mililitros de punto cero a 15, 500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mantenga diez microlitros del producto de enriquecimiento.
Añadir 200 microlitros de agua sin nucleasas al tubo y mezclar por vórtice. Centrifugar el tubo de dos mililitros de punto cero de nuevo. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 microlitros del producto de enriquecimiento.
Añadir 90 microlitros de agua sin nucleasas al tubo y mezclar por vórtice. Para preparar la plantilla, vórtice el control positivo y gire brevemente. Añadir cinco microlitros del control positivo a 100 microlitros del producto de enriquecimiento.
Vórtice y centrífuga a 15,500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 microlitros de la plantilla. A continuación, agregue 20 microlitros de la imprimación de secuenciación y 15 microlitros del tampón de recocido al tubo de la plantilla.
Vórtice el tubo y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Incubar el tubo en un ciclor térmico con una tapa calentada. A continuación, añada 10 microlitros del búfer de carga al tubo.
Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Mezcle las 55 microlitros de la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo y cargue la muestra en el pozo de carga del chip. Mantenga la punta de pipeta usada y el tubo PCR de dos mililitros de punto cero.
Coloque el chip en la mini centrífuga de chip cuando entre alguna muestra en el chip. Compruebe la posición y centrifugar el chip durante 10 minutos. Prepare el tampón de 50% de recocido añadiendo 500 microlitros de tampón de recocido y 500 microlitros de agua sin nucleasas en un tubo de un punto de cinco mililitros.
Preparar la solución de lavado, añadiendo 500 microlitros de tampón de recocido y 500 microlitros de 100%2-propanol en un tubo de cinco mililitros de un punto. A continuación, preparar la mezcla de espuma, añadiendo 49 microlitros del tampón de recocido 50% y un microlitros de la solución de espuma a dos nuevos tubos de un punto y cinco mililitros. Pipetear el aire en una de las mezclas de espuma, y cargar 120 microlitros de las burbujas en el pozo de carga.
Transfiera el líquido expulsado excesivo del pozo de salida al pozo de carga, y centrifugar el chip durante 30 segundos en la mini centrífuga de la viruta. Repita el proceso para la segunda mezcla de espuma. Agregue 55 microlitros del tampón de recocido del 50% al tubo de cuatro mililitros mantenido.
Utilice la punta de pipeta mantenida para pipetear hacia arriba y hacia abajo. Cargue los 55 microlitros del tampón de recocido en el pozo de carga. Centrifugar el chip durante 30 segundos en la mini centrífuga de chip designada.
Cargue 100 microlitros de la solución de lavado en el pozo de carga de la viruta y deseche el líquido expulsado del pozo de salida. Repita este paso de carga una vez. Cargue 100 microlitros del búfer de recocido del 50%, en el pozo de carga de la viruta.
Repita este paso de carga para un total de tres veces. Agregue 60 microlitros del tampón de recocido al 50% y seis microlitros de la enzima de secuenciación en un nuevo tubo de un punto de cinco mililitros. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.
Pipeta lentamente 65 microlitros de esta solución mixta en el pozo de carga de la viruta, evitando las burbujas. Mantenga el chip alejado de la luz e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, después de la incubación, cargue inmediatamente el chip en el secuenciador y haga clic en Iniciar la secuenciación en la pantalla para iniciar la secuenciación.
Un análisis estadístico retrospectivo en 186 embriones en estadio de escisión y 1135 embriones en estadio de blastocisto dio como resultado más del 95% de las tasas de éxito de WGA en ambos tipos de muestras. Las tasas de fallo de control de calidad de secuenciación fueron del 3,4% en el grupo de etapa de escisión y solo del 1,9% en el grupo de etapas del blastocisto. Además de la aneuploidía, los datos de secuenciación se pueden utilizar para otros análisis.
Por ejemplo, copie las variaciones de números con un tamaño inferior a cinco megabase, o análisis de ADN micondrial, dependiendo de la profundidad y calidad de secuenciación. Con la mejora en las llamadas de número de copias, los investigadores pueden investigar más a fondo el futuro del mosaico cromosómico en embriones humanos en etapa temprana.
