우리가 여기에서 제시하는 프로토콜은 배아에 있는 무분비의 검열을 위한 신속하고 저가적인 반도체, 시퀀싱 기지를 둔 방법입니다. 템플릿 증폭을 수행하기 위한 정제 프로토콜과 시퀀싱 라이브러리의 배열로 인해 PGTA 감지를 재현가능하고 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약할 수 있습니다. 이 반도체 시퀀서의 런타임은 2~4시간밖에 되지 않습니다.
샘플 수신에서 보고서 발급까지 소요 시간을 5일로 단축합니다. 이 방법은 무분비 선별, 복사 번호 변형 및 단일 뉴클레오티드 다형성 호출을 위한 게놈 시퀀싱을 제공한다. 다른 시퀀싱 화학으로 인해 이 프로토콜에 의해 준비된 라이브러리는 다른 시퀀싱 시스템에서 직접 시퀀싱할 수 없습니다.
그러나 동일한 시퀀서이지만 다른 라이브러리 준비는 비침습적 산전 검사를 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 샹춘 궈 (Xiangchun Guo)가 될 것입니다. 시퀀싱을 시작하려면 각 라이브러리를 희석하고 매번 3초 동안 미니 원심분리기에서 4회 회전합니다.
그런 다음 각 라이브러리의 5 개의 마이크로 리터를 가져 가서 핵이없는 1 점 5 밀리리터 튜브로 풀을 짜십시오. 혼합 된 라이브러리를 소용돌이하고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 회전시합니다. 두 개의 새로운 복구 튜브에 150 마이크로리터를 브레이킹 솔루션에 추가합니다.
새로운 복구 튜브, 복구 라우터 및 증폭 플레이트를 설치합니다. 오일 병을 세 번 반전시켜 섞는다. 오일 및 복구 솔루션이 모두 3분의 2 이상 가득 차 있는지 확인합니다.
마스터 믹스 PCR 버퍼를 30초 동안 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간략하게 회전합니다. 구 입자와 혼합 라이브러리를 1분 동안 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간략하게 회전합니다. 다음으로, 2400 마이크로리터 결찰 믹스를 준비하여, 뉴클레아제 없는 물 172마이크로리터, 혼합 라이브러리의 8마이크로리터, 효소 믹스의 120마이크로리터, 구입자의 100마이크로리터를 마스터 믹스 PCR 버퍼의 2000 마이크로리터를 함유하는 튜브에 첨가하여 제조한다.
파이펫을 800 마이크로리터로 설정하고 샘플 포트를 통해 반응 필터에 계합 믹스를 로드합니다. 오일 병을 세 번 반전시키고 P1000 파이펫을 사용하여 반응 필터에 반응 오일의 200 마이크로리터를 추가합니다. 프로그램 Proton을 선택한 다음 보조 버튼을 선택하여 모니터의 지침을 따라 장치가 올바르게 설정되었는지 확인합니다.
그런 다음 다음을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 에멀젼 PCR 제품 샘플 100마이크로리터, 세척된 구슬 130마이크로리터, ES 세척 용액 300마이크로리터, 용융용 300마이크로리터를 8개의 튜브 스트립에 적재한다. 8개의 튜브 스트립을 농축 시스템에 배치합니다.
파이펫 팁과 새로운 제로 포인트 2 밀리 리터 튜브를 설치하고 프로그램을 시작합니다. 원심 분리는 5 분 동안 15, 500 배 G에서 제로 포인트 2 밀리리터 튜브. 상체를 버리고 농축 제품의 10 마이크로리터를 유지하십시오.
200 마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 튜브에 넣고 소용돌이에 섞습니다. 원심 분리제로 2 밀리리터 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 농축 제품의 10 마이크로 리터를 유지하십시오.
90 마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 튜브에 넣고 소용돌이에 섞습니다. 템플릿을 준비하려면 양수 컨트롤을 소용돌이쳐 간략하게 회전합니다. 농축 제품의 100 마이크로리터에 양수 제어의 5 마이크로리터를 추가합니다.
소용돌이와 원심분리기는 15, 500배 G로 5분간. 상체를 버리고 템플릿의 마이크로리터 10을 유지합니다. 다음으로, 시퀀싱 프라이머의 마이크로리터 20개, 어닐링 버퍼 15마이크로리터를 템플릿 튜브에 추가합니다.
튜브를 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간단히 회전합니다. 가열 된 뚜껑열 사이클러에 튜브를 배양. 그런 다음 튜브에 로딩 버퍼의 마이크로리터 10을 추가합니다.
위아래로 파이프를 통해 섞는다. 시료 55마이크로리터를 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 샘플을 칩의 하중 우물에 로드합니다. 사용된 파이펫 팁과 제로 포인트 2 밀리리터 PCR 튜브를 유지합니다.
일부 샘플이 칩에 들어갈 때 칩을 칩 미니 원심분리기에 놓습니다. 위치를 확인하고 칩을 원심분리기를 10분 동안 확인합니다. 500 마이크로리터의 아닐링 버퍼와 500마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 1점 5밀리리터 튜브에 추가하여 50% 아닐링 버퍼를 준비합니다.
1점 5밀리리터 튜브에 100%2프로판올의 500마이크로리터와 500마이크로리터를 추가하여 플러싱 솔루션을 준비합니다. 이어서, 발포 혼합물을 준비하여, 50%의 안어 버퍼의 49마이크로리터와 발포용액 1개를 2개의 새로운 1점 5밀리리터 튜브에 첨가하였다. 파이펫 공기는 발포 혼합물 중 하나에 공기를 넣고, 거품의 120 마이크로리터를 하중에 잘 적재합니다.
출구에서 잘 배출된 액체를 잘 로딩으로 옮기고 칩 미니 원심분리기에서 30초 동안 칩을 원심분리합니다. 제2 발포 혼합물에 대한 과정을 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼55마이크로리터를 제로포인트 2밀리리터 튜브에 넣습니다.
유지 된 파이펫 팁을 사용하여 위아래로 파이펫을 사용합니다. 어닐링 버퍼의 55마이크로리터를 모두 적재에 잘 로드합니다. 지정된 칩 미니 원심분리기에서 칩을 30초 동안 원심분리합니다.
플러싱 용액 100마이크로리터를 칩 로딩에 잘 적재하고 출구에서 배출된 액체를 잘 폐기합니다. 이 로딩 단계를 한 번 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼의 100 마이크로리터를 칩 로딩에 잘 넣습니다.
총 세 번이 로드 단계를 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼60 마이크로리터와 시퀀싱 효소 6개를 새로운 1점 5밀리리터 튜브에 넣습니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다.
이 혼합 용액의 65 마이크로리터를 칩 로딩에 천천히 파이펫하여 거품을 피합니다. 칩을 빛으로부터 멀리 하고 실온에서 5분간 배양하십시오. 마지막으로 인큐베이션 후 칩을 시퀀서에 즉시 로드하고 화면에서 시퀀싱 실행 시작을 클릭하여 시퀀싱을 시작합니다.
186개의 분열 단계와 1135개의 배반성 단계 배아에 대한 회고적 통계 분석은 두 가지 유형의 샘플모두에서 95% WGA 성공률이상을 초래했습니다. 시퀀싱 품질 관리 실패율은 분열 단계 그룹에서 3.4%, 배반구 단계 그룹에서는 1.9%에 불과했습니다. 분석 외에도 시퀀싱 데이터는 다른 분석에 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 시퀀싱 깊이 및 품질에 따라 5메가베이스 미만의 크기 또는 mycondrial DNA 분석을 가진 숫자 변형을 복사합니다. 복사 번호 호출의 개선으로, 연구원은 인간 초기 단계 배아에 있는 염색체 모자이즘의 미래를 더 조사할 수 있습니다.
