O protocolo que apresentamos aqui é um semicondutor rápido e de baixo custo, métodos baseados em sequenciamento para triagem de aneuploidia em embriões. O protocolo refinado para a realização da amplificação do modelo e os arranjos da biblioteca de sequenciamento torna a detecção PGTA reproduzível, de alto rendimento, econômica e de economia de tempo. O tempo de execução deste sequenciador semi-condutor é de apenas duas a quatro horas.
Encurtando o tempo de retorno do recebimento de amostras para a emissão de relatórios em cinco dias. Este método fornece sequenciamento de genoma para triagem de aneuploide, variação de número de cópia e chamadas de polimorfismo de nucleotídeos únicos. Devido a diferentes químicas de sequenciamento, a biblioteca preparada por este protocolo não pode ser sequenciada diretamente em outros sistemas de sequenciamento.
Mas o mesmo sequenciador, mas diferente preparação da biblioteca, é capaz de fazer triagem pré-natal não invasiva. Demonstrando o procedimento será Xiangchun Guo, um técnico do nosso laboratório. Para começar o sequenciamento, vórtice cada biblioteca diluída e gire brevemente quatro vezes na mini centrífuga por três segundos cada vez.
Em seguida, pegue cinco microliters de cada biblioteca, para se juntar ao tubo sem núcleo, um ponto cinco mililitros. Vórtice a biblioteca mista e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Adicione 150 microliters da solução de quebra, a dois novos tubos de recuperação.
Instale os novos tubos de recuperação, o roteador de recuperação e a placa de amplificação. Misture invertendo a garrafa de óleo três vezes. Certifique-se de que tanto a solução de óleo quanto a solução de recuperação estão pelo menos dois terços cheios.
Vortex o buffer mestre mix PCR por 30 segundos e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Vórtice as partículas da esfera e a biblioteca mista por um minuto e giro brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Em seguida, prepare uma mistura de ligadura de 2400 microlitres, adicionando 172 microliters de água sem nuclease, oito microliters da biblioteca mista, 120 microliters da mistura enzimática, e 100 microliters das partículas da esfera, ao tubo contendo 2000 microliters do buffer de mix principal PCR.
Coloque uma pipeta em 800 microliters e carregue a mistura de ligadura ao filtro de reação através da porta da amostra. Inverta a garrafa de óleo três vezes e use uma pipeta P1000 para adicionar 200 microliters do óleo de reação ao filtro de reação. Selecione o proton do programa e selecione o botão assistido, para garantir que o dispositivo tenha sido configurado corretamente, seguindo as instruções no monitor.
Em seguida, clique em "Em seguida, para iniciar o programa". Carregue 100 microliters da amostra do produto PCR emulsion, 130 microliters das contas lavadas, 300 microliters da solução de lavagem ES e 300 microliters da solução de derretimento na tira de oito tubos. Coloque a tira de oito tubos no sistema de enriquecimento.
Instale uma ponta de pipeta e um novo tubo zero ponto dois mililitros e inicie o programa. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitros a 15.500 vezes G durante cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha dez microliters do produto de enriquecimento.
Adicione 200 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitro novamente. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do produto de enriquecimento.
Adicione 90 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Para preparar o modelo, vórtice o controle positivo e girar brevemente. Adicione cinco microliters do controle positivo a 100 microliters do produto de enriquecimento.
Vórtice e centrífuga a 15.500 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do modelo. Em seguida, adicione 20 microliters do primer de sequenciamento e 15 microliters do tampão de ressarcimento ao tubo de modelo.
Vórtice do tubo e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Incubar o tubo em um cicloviário térmico com uma tampa aquecida. Em seguida, adicione 10 microliters do tampão de carga ao tubo.
Misture por pipetting para cima e para baixo. Misture os 55 microliters da amostra por tubulação para cima e para baixo e carregue a amostra para o poço de carregamento do chip. Mantenha a ponta de pipeta usada e o tubo PCR de dois mililitros de ponto zero.
Coloque o chip na mini centrífuga do chip quando alguma amostra entrar no chip. Verifique a posição e centrifufique o chip por 10 minutos. Prepare 50% de tampão de enraizamento adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de água sem nuclease em um tubo de um ponto cinco mililitros.
Prepare a solução de descarga, adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de 100%2-propanol em um tubo de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, prepare a mistura de espuma, adicionando 49 microlitadores do buffer de 50% de enraizamento e um microliter da solução de espuma para dois novos tubos de um ponto cinco mililitros. Pipeta ar em uma das misturas de espuma, e carregar 120 microliters das bolhas no poço de carregamento.
Transfira o líquido expelido excessivo da saída bem para o poço de carregamento, e centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga do chip. Repita o processo para a segunda mistura de espuma. Adicione 55 microliters do buffer de 50% de ressarcimento ao tubo mantido em ponto zero dois mililitros.
Use a ponta de pipeta mantida para pipeta para cima e para baixo. Carregue todos os 55 microliters do tampão de ressarcimento até o poço de carregamento. Centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga de chip designada.
Carregue 100 microliters da solução de descarga no poço de carregamento do chip e descarte o líquido expelido do poço de saída. Repita esta etapa de carregamento uma vez. Carregue 100 microliters do buffer de 50%, no poço de carregamento do chip.
Repita esta etapa de carregamento para um total de três vezes. Adicione 60 microliters do buffer de 50% de enraizamento e seis microliters da enzima sequenciamento em um novo tubo de cinco mililitros de um ponto. Misture por pipetting para cima e para baixo.
Pipeta lentamente 65 microliters desta solução mista no poço de carregamento do chip, evitando bolhas. Mantenha o chip longe da luz e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Finalmente, após a incubação, carregue imediatamente o chip no sequenciador e clique em Iniciar a Sequência de Execução na tela para iniciar o sequenciamento.
Uma análise estatística retrospectiva em 186 estágio de decote e 1135 embriões de estágio blastocisto resultou em taxas de sucesso de mais de 95% de WGA em ambos os tipos de amostras. As taxas de falha de controle de qualidade de sequenciamento foram de 3,4% no grupo de estágio de decote e apenas 1,9% no grupo de estágio blastocisto. Além da aneuploidia, os dados de sequenciamento podem ser usados para outras análises.
Por exemplo, copiam variações numénicas com um tamanho inferior a cinco megabase, ou análise de DNA mycondrial, dependendo da profundidade e qualidade do sequenciamento. Com a melhoria na chamada do número de cópias, os pesquisadores podem investigar ainda mais o futuro do mosaico cromossômico em embriões em estágio inicial humano.
