من بين الاستراتيجيات المختلفة لإنتاج البروتين المؤتلف في النباتات ، يوفر تعبير VERS النباتي المفكك أداءً فائقًا ، مما يؤدي إلى غلة عالية على مدى فترة زمنية قصيرة نسبية. إن تكرار هذه التكنولوجيا لإنتاج لقاح فموي ينطوي على إمكانات كبيرة ليصبح بديلاً عن اللقاحات التقليدية في المستقبل القريب. أوراق البنجر الأحمر الLyophilized تحول بشكل عابر يتراكم كمية من مستضدات الصورة مناسبة للتحريض التسامح عن طريق الفم في الوقاية من مرض السكري من النوع الأول.
ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول التجريبي ليشمل العديد من الأنواع الصالحة للأكل المختلفة بعد تقييم كل حالة على حدة لتراكم البروتين المؤتلف. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون إدواردو بيرتيني، وماتيا سانتوني، وآنا كوكورولو، وروبرتا زامبيري. لبدء هذا الإجراء، تنمو البنجر الأحمر والنباتات السبانخ في غرفة النمو كما هو مبين في بروتوكول النص.
بعد إنبات البذور، اخصح النباتات مرتين في الأسبوع مع محلول من الأسمدة المتاحة تجاريا بتركيز غرام واحد للتر الواحد. للتصفية الزراعية، استخدم السبانخ من العمر خمسة أسابيع وستة مصانع بنجر أحمر من العمر. بعد بناء ناقلات التعبير النباتية، تلقيح المحولات الثلاثة A.tumefaciens في 50 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على ريفامبيسين بتركيز 50 ميكروغرام لكل ملليلتر والمضادات الحيوية الموجهة المحددة على النحو المبين في بروتوكول النص.
تنمو عن طريق هز بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية. في اليوم التالي، بيليه الثقافات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 4500 مرات G لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في 100 ملليلتر من حاجز التسلل التي تحتوي على 10 ميوس ميليمولار و 10 ميليمولار سلفات المغنيسيوم.
احتضان التعليقات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. مزيج حجم متساو من تعليق البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات المعروضة هنا، مع وحدة رئيس الوزراء خمسة ووحدة integrase. باستخدام حقنة دون إبرة، أخرج خمسة ملليلترات من مزيج التعليق.
اضغط على طرف الحقنة ضد الجانب السفلي من ورقة النبات أثناء تطبيق ضغط مضاد بلطف على الجانب الآخر من الورقة. التسلل إلى أول ثلاثة أوراق الموسعة تماما، بدءا من قمة، لكل مصنع. تسمية الأوراق الزراعية المصفاة مع علامة الورق على جذع الورقة.
ثم العودة إلى النباتات إلى غرفة النمو في ظل الظروف القياسية. في الأيام 4-14 بعد العدوى، وجمع الأوراق الزراعية المرشحة وتجميدها في النيتروجين السائل. تخزين هذا النسيج النباتي في ناقص 80 درجة مئوية.
أولاً، تنمو بشكل منفصل المحولات A.tumefaciens الثلاثة في 50 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على ريفامبيسين بتركيز 50 ميكرولتر لكل ملليلتر، والمضادات الحيوية المناسبة للنواقل المحددة عن طريق الاهتزاز بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. في اليوم التالي، بيليه الثقافات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 4500 مرات G لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في 1 لتر من التسلل العازلة لOD600 من 0.35، واحتضان التعليقات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات.
ثم إضافة 0.01٪ من المنظفات إلى كل تعليق. مزيج حجم متساو من تعليق البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات المعروضة هنا مع وحدة رئيس الوزراء خمسة ووحدة integrase. إدراج واحد ستة أسابيع من العمر نبات البنجر الأحمر في حامل.
عكس حامل ووضعها على رأس منقار يحتوي على اثنين لتر من حمام تسلل لغمر الأوراق في تعليق التسلل. بعد ذلك، نقل حمام التسلل مع النبات المغمور إلى غرفة التسلل وإغلاقه. بدوره على مضخة فراغ وفتح صمام التفريغ على غرفة التسلل.
مرة واحدة في الضغط في الغرفة قد انخفض إلى 90 ملليبار، والحفاظ على الفراغ لمدة ثلاث دقائق. ثم حرر الفراغ لمدة 45 ثانية. عندما عادت الغرفة إلى الضغط الجوي، افتح الغرفة وأزل النبات المتسلل من الحمام البكتيري.
إعادة المصنع إلى غرفة النمو. في يوم التعبير الأقصى ، حصاد الأوراق المتسللة وتجميدها في النيتروجين السائل كما هو موضح سابقا. أولا، حصاد فراغ الزراعية المصفاة دلتا 87 GAD65mut التعبير عن أوراق البنجر الأحمر في ذروة التعبير، وتجميدها في النيتروجين السائل.
lyophilize الأوراق المجمدة في ناقص 50 درجة مئوية و 0.04 ملليبار لمدة 72 ساعة. ثم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. عندما تكون على استعداد للمضي قدما، طحن الأوراق إلى مسحوق ناعم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في حاوية مختومة مع هلام السيليكا لاستبعاد الرطوبة.
لمحاكاة الهضم المعدة، تزن 100 ملليغرام من تجميد الأرض ناعما المجففة أوراق البنجر الأحمر، و resuspend في ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. استخدم ستة حمض هيدروكلوريك مولي لضبط درجة الحموضة العينة إلى اثنين. إضافة أربعة ملليغرام لكل ملليلتر البيبسين من الغشاء المخاطي في المعدة المسامية، و 10 ملليمولر حمض الهيدروكلوريك، للحصول على تركيز البيبسين النهائي من ملليغرام واحد لكل ملليلتر.
هز العينة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. بعد ذلك، استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة هيدروكسيد الH عينة إلى ثمانية وactivate البيبسين. نقل 750 ميكرولتر aliquots من كل عينة إلى أنابيب microcentrifuge، والطرد المركزي aliquots في 20،000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
جمع كل افرا على حدة، وإعادة تعليق كل بيليه في حجم واحد فائقة من العازلة التحميل. ثم تحليل كل من فائقة وبيليه resuspended من قبل تحليل لطخة الغربية. لتحليل سلامة الخلية، وإعداد عينتين من 100 ملليغرام من أوراق البنجر الأحمر المجففة تجميد الأرض ناعما، و resuspend على حد سواء في ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
استخدم ستة حمض هيدروكلوريك مولي لضبط درجة الحموضة لعينة واحدة إلى اثنين. صافح كلتا العينتين على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. ثم aliquot 750 ميكرولترات من كل عينة إلى أنابيب microcentrifuge.
جهاز طرد مركزي في 20،000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع كل افرا على حدة، وإعادة تعليق كل بيليه في حجم واحد فائقة من العازلة التحميل. ثم تحليل كل من فائقة وبيليه resuspended من قبل تحليل لطخة الغربية.
أولاً، تزن 100 ملليغرام من أوراق البنجر الأحمر المجففة بالتجميد الأرضي ناعماً، ثم تُعَد في ثمانية ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم. دوامة لمدة دقيقة واحدة. لوحة ملليلتر واحد من كل تجانس ورقة المجففة تجميد في واحدة من خمسة وسائل الإعلام LB انتقائية أعدت.
احتضان لوحات في 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، عد مستعمرات البكتيريا الزراعية التي تزرع على كل لوحة، وحساب الشحنة البكتيرية المتبقية كعدد وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر من متجانس الأوراق المجففة بالتجميد. في هذا العمل، يتم تطوير لقاح عن طريق الفم في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل.
يتم نقش النباتات البنجر والسبانخ الحمراء يدوياً بالتصفية الزراعية مع تعليق A.tumefaciens تحمل ناقلات التعبير المؤتلفة EGFP ، ويتم تصور تعبير البروتين الفلورسنت من خلال تحليل البقعة الغربية ويتم قياسه كميًا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتميز نظام البنجر الأحمر بتعبير EGFP أعلى ، حيث يصل إلى ما يقرب من 544 ميكروغرامًا لكل غرام من وزن الأوراق الطازجة في تسعة أيام بعد العدوى ، في حين أن السبانخ وصلت فقط إلى مستوى أقصى يبلغ حوالي 113.4 ميكروغرامًا لكل غرام من وزن الأوراق الطازجة في 11 يومًا بعد العدوى. وبسبب هذا، يتم تحديد البنجر الأحمر كمضيف التعبير لكافة التجارب اللاحقة.
ثم يتم اختراق النباتات الفراغ مع تعليق A.tumefaciens. بعد استخراج TSP من أوراق الترشيح الزراعي، يتم تحليل العينات بواسطة لطخة غربية، ويتم قياس كمية البروتين المؤتلف نسبيا من خلال تحليل قياس الكثافة. وأخيراً، يتم تقييم بارامترات تطوير لقاح فموي محتمل.
كما رأينا هنا، يُنظر إلى البروتين المستهدف على أنه مستقر بعد عملية التجميل. يتم محاكاة هضم المعدة عن طريق إضافة إنزيم المعدة البيبسين المسامي إلى المواد المجففة بالتجميد ، إما إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل ملليلتر ، أو نسبة 1 إلى 20 ، إلى TSP. كلا ظروف العلاج الهضمي يؤدي إلى تدهور البروتين المؤتلف.
عدم وجود إشارة محددة في عينات بيليه بعد هضم البيبسين تشير إلى أنه بعد تجميد التجفيف، فقدت الخلايا النباتية سلامتها، وهذا أدى إلى تدهور البروتين المستهدف. وينبغي تكييف الإجراء بعناية مع الأنواع النباتية فيما يتعلق بالتسرب الفراغي والبروتين المؤتلف المستهدف فيما يتعلق بتحليل الدورة الزمنية. ويمكن أيضاً استخدام الإجراء البرهاني لإنتاج الأدوية البيولوجية المعدة للتسليم الفموي، مثل اللقاح والأجسام المضادة.
