식물에서 재조합 단백질의 생산을위한 다른 전략 중, 해체 된 식물 기반 VERS 발현은 상대적으로 짧은 시간 프레임에 걸쳐 높은 수율로 이어지는 우수한 성능을 제공합니다. 경구 백신의 생산을 위한 이 기술의 복제는 가까운 장래에 전통적인 백신에 대한 대안이 될 큰 잠재력을 가지고 있습니다. Lyophilized 빨간 사탕무 잎은 일시적으로 변형 된 타입-1 당뇨병 예방에서 경구 내성 유도에 적합한 사진 항원의 양을 축적한다.
이 실험 프로토콜은 재조합 단백질 축적의 사례별 평가 후에 많은 다른 식용 종으로 확장될 수 있었습니다. 절차를 시연하는 것은 에도아르도 베르티니, 마티아 산토니, 안나 쿠쿠룰로, 로버타 잠피에리입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성장 챔버에서 붉은 사탕무와 시금치 식물을 성장시하십시오.
종자 발아 후, 리터 당 1 그램의 농도로 시판 되는 비료의 용액으로 일주일에 두 번 식물을 비옥하게. 농약의 경우 5주 된 시금치와 6주 된 붉은 사탕무 식물을 사용하십시오. 식물 발현 벡터를 생성한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 밀리리터 당 50 마이크로그램의 농도로 리팜피신을 함유하는 LB 배지의 50 밀리리터에서 3개의 A.tumefaciens 변압제를 접종한다.
섭씨 28도에서 하룻밤 을 흔들어 성장. 다음 날, 20 분 동안 4500 배 G에서 원심분리하여 세균 배양을 펠릿. 10 밀리머 MES와 10 밀리머 마그네슘 황산염을 포함하는 침투 완충제의 100 밀리리터에서 펠릿을 재중단.
실온에서 3시간 동안 서스펜션을 배양합니다. 5개의 프라임 모듈과 테그라스 모듈과 함께 여기에 표시된 모듈 중 하나를 포함하는 세균 현탁액의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 바늘없이 주사기를 사용하여 서스펜션 믹스의 5 밀리리터를 꺼내십시오.
잎의 반대편에 부드럽게 카운터 압력을 가하면서 식물 잎의 밑면에 주사기의 끝을 누릅니다. 각 식물에 대해 정점부터 시작하여 완전히 확장된 처음 3개의 잎에 침투합니다. 잎 줄기에 종이 태그와 함께 농구침 잎을 라벨.
그런 다음 표준 조건하에서 식물을 성장 챔버로 되돌려 보입니다. 4일에서 14일 동안, 농약잎을 모아 액체 질소로 동결한다. 이 식물 조직을 영하 80도에 보관하십시오.
첫째, 밀리리터당 50마이크로리터의 농도로 리팜피신을 함유하고 있으며, 28°C에서 하룻밤 사이에 흔들어 적절한 벡터 특이적 항생제를 함유하고 있는 LB 배지의 50밀리리터에서 3개의 A.tumefaciens 변압제를 별도로 성장시킨다. 다음 날, 20 분 동안 4500 배 G에서 원심분리하여 세균 배양을 펠릿. 침투 버퍼 1리터에서 펠릿을 0.35의 OD600으로 재차 중단하고 실온에서 3시간 동안 서스펜션을 배양한다.
그런 다음 각 현탁액에 세제의 0.01 %를 추가하십시오. 여기에 표시된 모듈 중 하나를 포함하는 세균 현탁액의 동일한 볼륨을 5개의 프라임 모듈 및 인테그라스 모듈과 혼합합니다. 6주 된 붉은 사탕무 식물을 홀더에 삽입합니다.
홀더를 뒤집어 침투 현탁액에 잎을 잠수하기 위해 침투 목욕의 두 리터가 들어있는 비커 위에 놓습니다. 그런 다음 침수된 식물과 함께 침투 목욕을 침투 챔버로 옮기고 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 침투 챔버에서 진공 섭취 밸브를 엽니다.
챔버의 압력이 90 밀리바로 떨어지면 3 분 동안 진공을 유지하십시오. 그런 다음 진공을 45초 동안 놓습니다. 챔버가 대기압으로 돌아왔을 때 챔버를 열고 세균 성 욕조에서 침투 된 식물을 제거하십시오.
식물을 성장 챔버로 되돌려 보입니다. 최대 발현의 날에, 침투 잎을 수확하고 이전에 설명한 대로 액체 질소로 동결하십시오. 먼저, 진공 농약형 델타 87 GAD65mut을 수확하여 발현 피크에서 붉은 사탕무 잎을 표현하고 액체 질소로 동결한다.
냉동 잎은 영하 50도, 72시간 동안 0.04 밀리바에서 냉동 잎을 사용한다. 그런 다음 영하 80도에서 보관하십시오. 진행 할 준비가되면, 미세 분말에 잎을 갈기와 수분을 제외 실리카 젤 밀봉 용기에 실온에 저장합니다.
위 소화 시뮬레이션의 경우, 미세하게 갈은 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 무게를 측정하고 PBS의 6 밀리리터로 다시 중단합니다. 6개의 어금반 염산을 사용하여 시료 pH를 2개로 조절합니다. 돼지 위 점막에서 밀리리터 펩신 당 4 밀리그램을 추가하고, 10 밀리머 염산, 밀리리터 당 1 밀리그램의 최종 펩신 농도를 얻을 수 있습니다.
샘플을 섭씨 37도에서 120분간 흔들어 줍니다. 다음으로, 수산화 나트륨을 사용하여 샘플 pH를 8으로 조정하고 펩신을 비활성화합니다. 각 시료의 750마이크로리터 알리쿼트를 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고, 알리쿼트를 20, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 원심분리합니다.
각 상체를 별도로 수집하고 각 펠릿을 하나의 상중 부피로 적재 버퍼로 재보선합니다. 그런 다음 서양 얼룩 분석에 의해 상류체 및 재중단 펠릿을 모두 분석합니다. 세포 무결성 분석을 위해, 잘게 갈아 간 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 두 샘플을 준비하고 PBS의 6 밀리리터에서 모두 다시 중단합니다.
6개의 어금반 염산을 사용하여 한 샘플의 pH를 2개로 조정합니다. 두 샘플을 섭씨 37도에서 120분간 흔들어 줍니다. 그런 다음 각 샘플의 750 마이크로리터를 마이크로센트심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.
원심분리기는 20, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안. 각 상체를 별도로 수집하고 각 펠릿을 하나의 상중 부피로 적재 버퍼로 재보선합니다. 그런 다음 서양 얼룩 분석에 의해 상류체 및 재중단 펠릿을 모두 분석합니다.
첫째, 미세하게 갈은 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 무게를 달고 멸균 PBS의 8 밀리리터로 다시 보관하십시오. 1 분 동안 소용돌이. 5개의 제조된 선택적 LB 매체 중 하나에서 각 동결 건조 잎 균주제의 1밀리리터를 플레이트.
3 일 동안 28섭씨에서 접시를 배양하십시오. 그 후, 각 판에서 자란 농균 콜로니를 계산하고, 동결 건조 잎 균형제의 밀리리터 당 식민지 형성 단위의 수로 잔류 세균전전을 계산한다. 이 작품에서, 경구 백신은 식용 식물 조직에서 개발된다.
붉은 사탕무와 시금치 식물은 EGFP 재조합 발현 벡터를 운반하는 A.tumefaciens의 현탁액으로 수동으로 농약으로 침투하며, 형광 단백질 발현은 서양 얼룩 분석에 의해 시각화되고 UV 빛 하에서 정량화된다. 빨간 사탕무 시스템은 더 높은 EGFP 발현을 특징으로하며, 감염 후 9 일 동안 신선한 잎 무게그램 당 약 544 마이크로 그램에 도달하는 반면 시금치는 감염 후 11 일 동안 신선한 잎 무게 그램 당 약 113.4 마이크로 그램의 최대 수준에 도달했습니다. 이 때문에 모든 후속 실험에 대해 빨간색 사탕무가 표현 주전 호스트로 선택됩니다.
그런 다음 식물은 A.tumefaciens 서스펜션으로 진공 침투됩니다. 농약침 잎으로부터 TSP 추출 후, 샘플은 서양 블롯에 의해 분석되고, 재조합 단백질은 밀도 분석에 의해 상대적으로 정량화된다. 마지막으로, 잠재적인 경구 백신의 발달을 위한 파라미터가 평가된다.
여기에서 볼 수 있듯이, 표적 단백질은 lyophilization 과정 후에 안정되는 것으로 보입니다. 위 소화는 동결 건조 물질에 돼지 위 효소 펩신을 추가하여 시뮬레이션되며, 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도 또는 TSP에 1-20의 비율로 시뮬레이션됩니다. 두 소화 치료 조건 재조합 단백질의 저하 귀착됩니다.
펩신 소화 후 펠릿 샘플에 특정 신호의 부재는 동결 건조 후, 식물 세포가 무결성을 잃고, 이것은 대상 단백질 저하로 이어졌다는 것을 시사한다. 절차는 진공 침투와 시간 과정 분석과 관련하여 대상 재조합 단백질에 대해 식물 종에 신중하게 적응해야합니다. 시연 절차는 또한 백신 및 항체 같이 경구 납품을 위한 bio pharmaceutical의 생산을 위해 사용될 지도 모릅니다.
