Parmi les différentes stratégies de production de protéines recombinantes dans les plantes, l’expression vers déconstruite à base de plantes offre des performances supérieures, conduisant à des rendements élevés sur une période relativement courte. La réplication de cette technologie pour la production d’un vaccin oral présente un grand potentiel pour devenir une alternative aux vaccins conventionnels dans un proche avenir. Les feuilles de betterave rouge lyophilisées transformées de façon transitoire accumulent une quantité d’antigènes photo adaptés à l’induction de tolérance orale dans la prévention du diabète de type 1.
Ce protocole expérimental pourrait être étendu à de nombreuses espèces comestibles différentes après une évaluation au cas par cas de l’accumulation de protéines recombinantes. Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo et Roberta Zampieri feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, cultivez des plants de betteraves rouges et d’épinards dans une chambre de croissance tel que décrit dans le protocole du texte.
Après la germination des graines, fertiliser les plantes deux fois par semaine avec une solution d’engrais disponible dans le commerce à une concentration d’un gramme par litre. Pour l’agroinfiltration, utilisez des épinards de cinq semaines et des betteraves rouges vieilles de six semaines. Après avoir construit les vecteurs d’expression végétale, inoculer les trois transformateurs A.tumefaciens en 50 millilitres de milieu LB contenant de la rifampicine à une concentration de 50 microgrammes par millilitre et d’antibiotiques spécifiques au vecteur tel que décrit dans le protocole textuel.
Poussez en secouant pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain, pelleter les cultures bactériennes en centrifugant à 4500 fois G pendant 20 minutes. Resuspendez la pastille en 100 millilitres de tampon d’infiltration contenant 10 millimilliles de MES et 10 millimolaires de sulfate de magnésium.
Incuber les suspensions à température ambiante pendant trois heures. Mélangez un volume égal d’une suspension bactérienne contenant l’un des modules présentés ici, avec le module cinq premiers et le module d’intégrase. À l’aide d’une seringue sans aiguille, sortir cinq millilitres du mélange de suspension.
Appuyez sur le bout de la seringue contre le dessous de la feuille de plante tout en appliquant doucement contre la pression de l’autre côté de la feuille. Infiltrer les trois premières feuilles complètement élargies, à partir de l’apex, pour chaque plante. Étiquetez les feuilles agroinfiltrées avec l’étiquette en papier sur la tige de la feuille.
Retournez ensuite les plantes à la chambre de croissance dans des conditions standard. Les jours quatre à 14 post-infection, recueillir les feuilles agroinfiltrées et les congeler dans de l’azote liquide. Conservez ce tissu végétaux à moins 80 degrés Celsius.
Tout d’abord, cultivez séparément les trois transformateurs A.tumefaciens en 50 millilitres de moyenne LB contenant de la rifampicine à une concentration de 50 microlitres par millilitre, et des antibiotiques spécifiques aux vecteurs appropriés en secouant pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain, pelleter les cultures bactériennes en centrifugant à 4500 fois G pendant 20 minutes. Resuspendez la pastille dans 1 litre de tampon d’infiltration à un OD600 de 0,35, et incuber les suspensions à température ambiante pendant trois heures.
Ajouter ensuite 0,01% du détergent à chaque suspension. Mélangez un volume égal d’une suspension bactérienne contenant l’un des modules présentés ici avec le module cinq premiers et le module d’intégrase. Insérez une betterave rouge de six semaines dans le support.
Inversez le support et placez-le sur un bécher contenant deux litres d’un bain d’infiltration pour submerger les feuilles dans la suspension d’infiltration. Après cela, transférez le bain d’infiltration avec la plante submergée à la chambre d’infiltration et fermez-la. Allumez la pompe à vide et ouvrez la vanne d’admission sous vide sur la chambre d’infiltration.
Une fois que la pression dans la chambre est tombée à 90 millibar, maintenir le vide pendant trois minutes. Relâchez ensuite le vide pendant 45 secondes. Lorsque la chambre est revenue à la pression atmosphérique, ouvrez la chambre et retirez la plante infiltrée du bain bactérien.
Remettre l’usine dans la chambre de croissance. Le jour de l’expression maximale, récolter les feuilles infiltrées et les congeler dans de l’azote liquide comme décrit précédemment. Tout d’abord, récolter le delta agroinfiltré sous vide 87 GAD65mut exprimant les feuilles de betterave rouge au pic d’expression, et les congeler dans de l’azote liquide.
Lyophiliser les feuilles gelées à moins 50 degrés Celsius et à 0,04 millibar pendant 72 heures. Rangez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à procéder, moudre les feuilles en poudre fine et les conserver à température ambiante dans un contenant scellé avec du gel de silice pour exclure l’humidité.
Pour la simulation de digestion gastrique, pesez 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et dépensez-les en six millilitres de PBS. Utilisez six acides chlorhydriques molaire pour ajuster le pH de l’échantillon à deux. Ajouter quatre milligrammes par millilitres de pepsine de muqueuse gastrique porcine, et 10 millimolaire d’acide chlorhydrique, pour obtenir une concentration finale de pepsine d’un milligramme par millilitre.
Agiter l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes. Ensuite, utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH de l’échantillon à huit et inactiver la pepsine. Transférer 750 aliquots microlitres de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugeuse, et centrifuger les aliquots à 20 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Recueillir chaque supernatant séparément, et resuspendre chaque granulé dans un volume supernatant de tampon de chargement. Ensuite, analyser à la fois le supernatant et la pastille résuspendée par l’analyse des taches occidentales. Pour l’analyse de l’intégrité cellulaire, préparez deux échantillons de 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et résuspendez les deux en six millilitres de PBS.
Utilisez six acides chlorhydriques molaire pour ajuster le pH d’un échantillon à deux. Agiter les deux échantillons à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes. Puis aliquot 750 microlitres de chaque échantillon aux tubes de microcentrifugeuse.
Centrifugeuse à 20 000 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Recueillir chaque supernatant séparément, et resuspendre chaque granulé dans un volume supernatant de tampon de chargement. Ensuite, analyser à la fois le supernatant et la pastille résuspendée par l’analyse des taches occidentales.
Tout d’abord, pesez 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et résépendez-les en huit millilitres de PBS stérile. Vortex pendant une minute. Plaquez un millilitre de chaque homogénéité de feuilles lyophilisés dans l’un des cinq supports LB sélectifs préparés.
Incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant trois jours. Par la suite, comptez les colonies d’agrobactéries cultivées sur chaque plaque et calculez la charge bactérienne résiduelle comme le nombre d’unités de formation de colonies par millilitre de l’homogénéité lyophilisé des feuilles. Dans ce travail, un vaccin oral est développé dans les tissus végétaux comestibles.
Les plants de betteraves rouges et d’épinards sont manuellement agroinfiltrés avec des suspensions d’A.tumefaciens porteurs de vecteurs d’expression recombinants EGFP, et l’expression des protéines fluorescentes est visualisée par l’analyse des taches occidentales et quantifiée sous la lumière UV. Le système de betteraves rouges se caractérise par une expression EGFP plus élevée, atteignant environ 544 microgrammes par gramme de poids des feuilles fraîches à neuf jours après l’infection, tandis que les épinards n’ont atteint qu’un niveau maximum d’environ 113,4 microgrammes par gramme de poids des feuilles fraîches sur 11 jours après l’infection. Pour cette raison, la betterave rouge est choisie comme hôte d’expression pour toutes les expériences ultérieures.
Les plantes sont ensuite infiltrées sous vide avec une suspension A.tumefaciens. Après l’extraction du TSP à partir de feuilles d’agroinfiltration, les échantillons sont analysés par tache occidentale, et la protéine recombinante est relativement quantifiée par une analyse de densitométrie. Enfin, les paramètres de développement d’un vaccin oral potentiel sont évalués.
Comme on le voit ici, la protéine cible est considérée comme stable après le processus de lyophilisation. La digestion gastrique est simulée en ajoutant l’enzyme gastrique porcine pepsine aux matériaux lyophilisés, soit à une concentration finale d’un milligramme par millilitre, soit à un rapport de un à 20, au TSP. Les deux conditions digestives de traitement ont comme conséquence la dégradation de la protéine recombinante.
L’absence d’un signal spécifique dans les échantillons de granulés après la digestion de la pepsine suggère qu’après le gel-séchage, les cellules végétales ont perdu leur intégrité, ce qui a conduit à la dégradation des protéines cible. La procédure doit être soigneusement adaptée aux espèces végétales en ce qui concerne l’infiltration sous vide et à la protéine recombinante cible en ce qui concerne l’analyse du cours du temps. La procédure de démonstration pourrait également être utilisée pour la production de produits biopharmaceutiques destinés à l’accouchement oral, comme le vaccin et les anticorps.
