在植物中生产重组蛋白的不同策略中，解构的基于植物的VERSS表达提供卓越的性能，在相对较短的时间范围内产生高产量。复制这一技术以生产口服疫苗具有在不久的将来成为传统疫苗替代品的巨大潜力。2月冻红甜菜叶瞬息万变积累大量适合口服耐受诱导的光抗原，预防1型糖尿病。
在对重组蛋白积累进行个案评估后，该实验方案可以扩展到许多不同的食用物种。演示手术的将是爱德华多·贝尔蒂尼、马蒂娅·桑托尼、安娜·库库鲁洛和罗伯塔·赞皮耶里。要开始此过程，请像文本协议中所述，在生长室中种植红甜菜和菠菜植物。
种子发芽后，每周用市售肥料溶液施肥两次，浓度为每升一克。对于农业过滤，使用五周大的菠菜和六周大的红甜菜植物。在构建植物表达载体后，在含有利福平的50毫升LB介质中接种三种 A.tumefaciens 转化剂，浓度为每毫升50微克，以及文本协议中概述的病媒特异性抗生素。
在28摄氏度下一夜之间摇晃生长。第二天，在4500次G下离心20分钟，对细菌培养物进行颗粒化。将颗粒重新注入含有 10 毫摩尔 MES 和 10 毫摩尔硫酸镁的 100 毫升渗透缓冲液中。
在室温下孵育悬浮液三小时。将包含此处所示的模块之一的细菌悬浮液的等量与五个质模块和整数模块混合。使用无针头的注射器，拿出五毫升的悬浮液混合物。
将注射器的尖端压在植物叶的底面上，同时轻轻对叶的另一侧施加反压。渗透到前三个完全膨胀的叶子，从顶点开始，每个植物。在叶茎上贴上纸标签，标记农业渗透的叶子。
然后在标准条件下将植物返回生长室。感染后的第4至14天，收集农业渗透的叶子，并在液氮中冷冻。将这种植物组织储存在零下80摄氏度。
首先，在50毫升的LB介质中分别种植三种 A.tumefacien 转化剂，其浓度为每毫升50微升，并在28摄氏度下过夜摇动，并提供适当的病媒特异性抗生素。第二天，在4500次G下离心20分钟，对细菌培养物进行颗粒化。将颗粒在 1 升渗透缓冲液中重新悬浮到 0.35 的 OD600 中，并在室温下孵育悬浮液三小时。
然后在每个悬浮液中加入0.01%的洗涤剂。将包含此处所示的模块之一的细菌悬浮液的等量与五个质模块和整数模块混合。将一个六周大的红色甜菜植物插入支架。
倒置支架，并放在装有两升渗透浴的烧杯上，将叶子淹没在渗透悬浮液中。之后，将浸入式植物的渗透浴转移到渗透室并关闭。打开真空泵并打开渗透室上的真空进气阀。
一旦腔室中的压力下降到 90 毫巴，保持真空三分钟。然后释放真空 45 秒。当腔室回到大气压力时，打开腔室，将渗入的植物从细菌浴中清除。
将工厂返回到生长室。在表达最大一天，收获渗透的叶子，并冻结在液氮，如前面所述。首先，在表达高峰期收获真空农业渗透三角洲87GAD65mut表示红甜菜叶，并在液氮中冷冻。
将冷冻叶在零下50摄氏度和0.04毫巴下冻干72小时。然后将它们储存在零下80摄氏度。准备好继续操作时，将叶子研磨成细粉末，并在室温下存放在密封的容器中，并含有硅胶，以排除水分。
对于胃消化模拟，重达100毫克的细磨冷冻干燥的红甜菜叶，并重新暂停在6毫升PBS。使用六摩尔盐酸将样品pH值调整为2。从猪胃粘膜中加入四毫克每毫升辣椒，加入 10 毫摩尔盐酸，以获得每毫升一毫克的最终百事可乐浓度。
在 37 摄氏度下摇动样品 120 分钟。接下来，使用氢氧化钠将样品pH值调整为8，并灭活辣椒。将每个样品的750微升等分转移到微离心管中，并在20，000倍G和4摄氏度下将等分离离心20分钟。
分别收集每个上一时分，并在一个上流负载缓冲器体积中重新暂停每个颗粒。然后通过西方印迹分析分析上重物和再增颗粒。对于细胞完整性分析，准备两个100毫克的细磨冻干红甜菜叶的样品，并在PBS的6毫升中重新暂停。
使用六摩尔盐酸将一个样品的 pH 值调整为两个。在37摄氏度下摇动两个样品120分钟。然后将每个样品的750微升分到微离心管。
在20，000倍G和4摄氏度的离心机20分钟。分别收集每个上一时分，并在一个上流负载缓冲器体积中重新暂停每个颗粒。然后通过西方印迹分析分析上重物和再增颗粒。
首先，重达100毫克的细磨冻干红甜菜叶，并重新暂停在8毫升无菌PBS。漩涡一分钟。在五种准备好的选择性 LB 介质中，每片冻干叶均质的一毫升板。
在28摄氏度下孵育板三天。在此之后，计算每个板上生长的农业菌菌群，并计算残留细菌电荷为冻干叶同质化每毫升形成单位的数量。在这项工作中，在可食用植物组织中研制出口服疫苗。
红甜菜和菠菜植物被手工农业渗透，悬挂的A.tumefacien携带EGFP重组表达载体，荧光蛋白表达通过西方印迹分析可视化，并在紫外线下进行量化。红甜菜系统的特点是EGFP表达较高，感染后9天达到每克新鲜叶体重约544微克，而菠菜在感染后11天仅达到每克新鲜叶体重约113.4微克的最大值。因此，红色甜菜被选为所有后续实验的表达式宿主。
然后，植物被真空渗透与 A.tumefaciens 悬浮液。从农业渗透叶中提取TSP后，用西方印迹对样品进行分析，通过密度测定分析对重组蛋白进行相对量化。最后，对潜在口服疫苗的研制参数进行了评价。
如这里看到，目标蛋白在冻干过程后保持稳定。通过将猪胃酶肽加入冷冻干燥物质，或将最终浓度为每毫升1毫克，或与TSP的1至20比比，模拟胃消化。两种消化治疗条件都会导致重组蛋白降解。
在肽消化后颗粒样品中缺乏特定信号表明，冷冻干燥后，植物细胞失去了完整性，这导致了目标蛋白的降解。在真空渗透方面，应仔细适应植物物种和目标重组蛋白的时间过程分析。示范程序也可用于生产用于口服分娩的生物制药，如疫苗和抗体。
