植物における組換えタンパク質の生産のための異なる戦略の中で、分解された植物ベースのVERS発現は、相対的な短い時間枠にわたって高い収率につながる優れた性能を提供する。経口ワクチンの製造のためのこの技術の複製は、近い将来、従来のワクチンに代わる大きな可能性を秘めています。一過性形質転換した凍結乾燥赤いビート葉は、1型糖尿病予防における経口耐性誘導に適した量のフォト抗原を蓄積する。
この実験プロトコルは、組換えタンパク質蓄積のケースバイケース評価の後、多くの異なる食用種に拡張することができる。この手順のデモンストレーションは、エドアルド・ベルティーニ、マッティア・サントーニ、アンナ・ククルッロ、ロベルタ・ザンピエリです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、成長室で赤いビートとほうれん草の植物を成長させます。
種子の発芽後、1リットル当たり1グラムの濃度で市販の肥料の溶液で週2回植物を受精させる。アグロインフィルトレーションの場合は、5週間齢のほうれん草と6週間齢の赤いビート植物を使用してください。植物発現ベクターを構築した後、テキストプロトコルで概説されているように、リファンピシンを含むLB培地の3つのA.tumefacienを50ミリリットルのLB培地で、ミリリットル当たり50マイクログラムの濃度で、ベクター特異的抗生物質で接種する。
摂氏28度で一晩振って成長する。翌日、4500倍Gで20分間遠心することにより細菌培養をペレット化した。10ミリモルMESと10ミリモル硫酸マグネシウムを含む浸潤緩衝液の100ミリリットルでペレットを再懸濁します。
懸濁液を室温で3時間インキュベートする。ここに示すモジュールの1つを含む細菌懸濁液の等量を、5つの素数モジュールとインテグラーゼモジュールと混合します。注射器を針なしで使用し、5ミリリットルの懸濁液を取り出す。
葉の反対側に軽くカウンター圧力をかけながら、シリンジの先端を植物葉の下側に押し付けます。最初の3つの完全に拡張された葉を、各植物の頂点から始めて浸入する。農浸し葉に葉の茎に紙のタグを付けてラベルを付けます。
次に、植物を標準条件下で成長室に戻します。感染後4~14日目には、浸潤した葉を採取し、液体窒素で凍結する。この植物組織をマイナス80度で保管してください。
まず、リファンピシンを含むLB培地の3つのA.tumefacienを1ミリリットル当たり50マイクロリットルの濃度で別々に成長させ、摂氏28度で一晩振ることによって適切なベクター特異的抗生物質を成長させる。翌日、4500倍Gで20分間遠心することにより細菌培養をペレット化した。1リットルの浸潤バッファーでペレットを0.35のOD600に再懸濁し、3時間室温で懸濁液をインキュベートする。
その後、各懸濁液に洗剤の0.01%を加えます。ここに示すモジュールの1つを含む細菌懸濁液の等容数を5つの素数モジュールとインテグラーゼモジュールと混合します。1 6週齢の赤いビート工場をホルダーに挿入します。
ホルダーを反転し、浸潤懸濁液中の葉を水没させるために浸潤浴の2リットルを含むビーカーの上に置きます。この後、浸潤槽に水没植物と浸潤浴を移し、それを閉じます。真空ポンプをオンにし、浸潤チャンバーの真空吸気バルブを開きます。
チャンバー内の圧力が90ミリバールに落ちたら、3分間真空を維持します。その後、真空を45秒間放出します。チャンバーが大気圧に戻ったら、チャンバーを開き、浸潤した植物を細菌風呂から取り除きます。
成長室に植物を返します。最大発現の日に、浸潤した葉を収穫し、前述のように液体窒素で凍結する。まず、発現ピーク時に赤いビートの葉を発現する真空アグローフィルトデルタ87GAD65mutを収穫し、液体窒素で凍結する。
凍った葉をマイナス50度、0.04ミリバールで72時間凍結乾燥させます。その後、マイナス80度で保存します。先に進む準備ができたら、葉を細かい粉末に粉砕し、シリカゲルで密閉された容器に室温で保存し、水分を除外します。
胃消化シミュレーションの場合、乾燥した赤いビートの葉を細かく粉砕した100ミリグラムの重さを量り、PBSの6ミリリットルで再中断します。サンプルpHを2に調整するために6モル塩酸を使用してください。ブタ胃粘膜からペプシン当たり4ミリグラム、塩酸10ミリモルを加え、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なペプシン濃度を得る。
37°Cでサンプルを120分間振ります。次に、水酸化ナトリウムを使用してサンプルpHを8に調整し、ペプシンを不活性化する。各サンプルの750マイクロリットルのアリコートをマイクロ遠心チューブに移し、20,000倍Gで4度の摂氏で遠心分離します。
各上清を別々に集め、各ペレットを積み込みバッファーの1つの上清体積で再懸濁する。次いで、ウェスタンブロット分析により上清と再懸濁ペレットの両方を分析します。細胞の完全性分析のために、細かく粉砕された凍結乾燥した赤いビートの葉の100ミリグラムの2つのサンプルを準備し、PBSの6ミリリットルで両方を再中断します。
1サンプルのpHを2個に調整するには、6モル塩酸を使用します。両方のサンプルを摂氏37度で120分間振ります。次に、各試料のアリコート750マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにする。
20,000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で20分間。各上清を別々に集め、各ペレットを積み込みバッファーの1つの上清体積で再懸濁する。次いで、ウェスタンブロット分析により上清と再懸濁ペレットの両方を分析します。
まず、細かく粉砕された凍結乾燥した赤いビートの葉の100ミリグラムを計量し、滅菌PBSの8ミリリットルでそれを再中断します。1分間渦。各凍結乾燥葉の1ミリリットルを、調製した5つの選択的LB培地のうちの1つにホモゲネートする。
3日間摂氏28度でプレートをインキュベートします。この後、各プレートに成長したアグロバクテリウムコロニーを数え、凍結乾燥葉ホモジネートの1ミリリットル当たりのコロニー形成単位数として残存細菌電荷を算出する。この研究では、経口ワクチンが食用植物組織で開発される。
赤いビートとほうれん草の植物は、EGFP組換え発現ベクターを運ぶA.tumefaciensの懸濁液で手動でアグロインフィルされ、蛍光タンパク質発現はウエスタンブロット分析によって可視化され、UV光下で定量されます。赤いビートシステムは、感染後9日間で新鮮な葉の重量のグラムあたり約544マイクログラムに達し、ほうれん草は感染後11日間に新鮮な葉の重量のグラム当たり約113.4マイクログラムの最大レベルに達しただけで、より高いEGFP発現を特徴とする。このため、赤いビートは、すべての後続の実験の式ホストとして選択されます。
その後、植物はA.tumefaciens懸濁液で真空浸潤されます。農浸潤葉からのTSP抽出後、試料をウェスタンブロットで分析し、組換えタンパク質を濃度測定法解析により相対的に定量する。最後に、潜在的な経口ワクチンの開発のためのパラメータが評価される。
ここで見られるように、標的タンパク質は凍結乾燥プロセスの後に安定であることがわかる。胃消化は、ブタ胃酵素ペプシンを凍結乾燥材料に加えることによってシミュレートされ、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度、または1〜20の比率をTSPに加える。両方の消化処理条件は、組換えタンパク質の分解をもたらす。
ペプシン消化後のペレットサンプルに特異的なシグナルがないことは、凍結乾燥後に植物細胞が完全性を失い、これが標的タンパク質分解につながったことを示唆している。この手順は、真空浸潤に関しては植物種に注意深く適応されるべきであり、タイムコース解析に関しては標的組換えタンパク質に適合させるべきである。デモンストレーション手順は、ワクチンや抗体などの経口送達を目的としたバイオ医薬品の製造にも使用される可能性があります。
