Entre las diferentes estrategias para la producción de proteína recombinante en plantas, la expresión DES a base de plantas deconstruida proporciona un rendimiento superior, lo que conduce a altos rendimientos en un período de tiempo relativamente corto. La replicación de esta tecnología para la producción de una vacuna oral tiene un gran potencial para convertirse en una alternativa a las vacunas convencionales en un futuro próximo. Las hojas de remolacha roja liofilizadas transformadas transitoriamente acumulan una cantidad de antígenos fotográficos adecuados para la inducción de tolerancia oral en la prevención de la diabetes tipo uno.
Este protocolo experimental podría extenderse a muchas especies comestibles diferentes después de una evaluación caso por caso de acumulación de proteínas recombinantes. Demostrarán el procedimiento serán Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo y Roberta Zampieri. Para comenzar este procedimiento, cultivar remolacha roja y plantas de espinacas en una cámara de crecimiento como se describe en el protocolo de texto.
Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces por semana con una solución de fertilizante comercialmente disponible a una concentración de un gramo por litro. Para la agroinfiltración, utilice espinacas de cinco semanas de edad y plantas de remolacha roja de seis semanas de edad. Después de construir los vectores de expresión vegetal, inocular los tres transformadores A.tumefaciens en 50 mililitros de medio LB que contiene rifampicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro y antibióticos específicos de vectores como se describe en el protocolo de texto.
Crece temblando durante la noche a 28 grados centígrados. Al día siguiente, peletizar los cultivos bacterianos por centrifugar a 4500 veces G durante 20 minutos. Resuspender el pellet en 100 mililitros de tampón de infiltración que contiene 10 MES mililolares y 10 sulfato de magnesio milimolar.
Incubar las suspensiones a temperatura ambiente durante tres horas. Mezclar un volumen igual de una suspensión bacteriana que contenga uno de los módulos que se muestran aquí, con el módulo de cinco primos y el módulo de integrasa. Con una jeringa sin aguja, saque cinco mililitros de la mezcla de suspensión.
Presione la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja de la planta mientras aplica suavemente la presión de contador al otro lado de la hoja. Infiltrar las tres primeras hojas completamente expandidas, a partir del ápice, para cada planta. Etiquete las hojas agroinfiltradas con la etiqueta de papel en el tallo de la hoja.
A continuación, devuelva las plantas a la cámara de crecimiento en condiciones estándar. En los días cuatro a 14 después de la infección, recoger las hojas agroinfiltradas y congelarlas en nitrógeno líquido. Almacene este tejido vegetal a menos 80 grados centígrados.
En primer lugar, crecer por separado los tres transformadores A.tumefaciens en 50 mililitros de medio LB que contiene rifampicina a una concentración de 50 microlitros por mililitro, y antibióticos específicos de vectores apropiados agitando durante la noche a 28 grados centígrados. Al día siguiente, peletizar los cultivos bacterianos por centrifugar a 4500 veces G durante 20 minutos. Resuspender el pellet en 1 litro de tampón de infiltración a un OD600 de 0.35, e incubar las suspensiones a temperatura ambiente durante tres horas.
A continuación, añada el 0,01% del detergente a cada suspensión. Mezclar un volumen igual de una suspensión bacteriana que contenga uno de los módulos que se muestran aquí con el módulo de cinco primos y el módulo de integrasa. Inserte una planta de remolacha roja de seis semanas de edad en el soporte.
Invierta el soporte y colóquelo encima de un vaso de precipitados que contenga dos litros de un baño de infiltración para sumergir las hojas en la suspensión de infiltración. Después de esto, transfiera el baño de infiltración con la planta sumergida a la cámara de infiltración y ciérrela. Encienda la bomba de vacío y abra la válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración.
Una vez que la presión en la cámara ha caído a 90 milibares, mantener el vacío durante tres minutos. A continuación, suelte el vacío durante 45 segundos. Cuando la cámara haya vuelto a la presión atmosférica, abra la cámara y retire la planta infiltrada del baño bacteriano.
Devuelva la planta a la cámara de crecimiento. El día de máxima expresión, cosecha las hojas infiltradas y congelarlas en nitrógeno líquido como se describió anteriormente. En primer lugar, cosechar el vacío agroinfiltrado delta 87 GAD65mut expresando hojas de remolacha roja en el pico de expresión, y congelarlas en nitrógeno líquido.
Liofilizar las hojas congeladas a menos 50 grados Celsius y a 0.04 milibar durante 72 horas. A continuación, guárdelos a menos 80 grados centígrados. Cuando esté listo para proceder, muele las hojas a un polvo fino y guárdelos a temperatura ambiente en un recipiente sellado con gel de sílice para excluir la humedad.
Para la simulación de digestión gástrica, pesar 100 miligramos de las hojas de remolacha roja seca congelada finamente molida, y resuspender en seis mililitros de PBS. Utilice seis molares de ácido clorhídrico para ajustar el pH de la muestra a dos. Añadir cuatro miligramos por mililitros de pepsina de la mucosa gástrica porcina, y 10 ácido clorhídrico milimolar, para obtener una concentración final de pepsina de un miligramo por mililitro.
Agitar la muestra a 37 grados centígrados durante 120 minutos. A continuación, utilice hidróxido de sodio para ajustar el pH de la muestra a ocho e inactivar la pepsina. Transfiera 750 microlitros alícuotas de cada muestra a tubos de microcentrífuga, y centrifuga las alícuotas a 20.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Recoger cada sobrenadante por separado, y resuspender cada pellet en un volumen de sobrenadante de búfer de carga. A continuación, analice tanto el sobrenadante como el pellet resuspendido por el análisis de manchas occidentales. Para el análisis de la integridad celular, preparar dos muestras de 100 miligramos de las hojas de remolacha roja liofilizado finamente molidas, y resuspender ambos en seis mililitros de PBS.
Utilice seis molares de ácido clorhídrico para ajustar el pH de una muestra a dos. Agitar ambas muestras a 37 grados centígrados durante 120 minutos. A continuación, aliquot 750 microlitros de cada muestra a tubos de microcentrífuga.
Centrifugar a 20.000 veces G y a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Recoger cada sobrenadante por separado, y resuspender cada pellet en un volumen de sobrenadante de búfer de carga. A continuación, analice tanto el sobrenadante como el pellet resuspendido por el análisis de manchas occidentales.
Primero, pesa 100 miligramos de las hojas de remolacha roja liofilizado finamente molidas, y la resuspend en ocho mililitros de PBS estéril. Vórtice por un minuto. Placa un mililitro de cada homogeneización de hoja liofilizada en uno de los cinco medios SELECTos DE LB preparados.
Incubar las placas a 28 grados centígrados durante tres días. Después de esto, contar las colonias de agrobacterium cultivadas en cada plato, y calcular la carga bacteriana residual como el número de unidades formadoras de colonias por mililitro del homogeneario de hoja liofilizada. En este trabajo, se desarrolla una vacuna oral en tejido vegetal comestible.
Las plantas de remolacha roja y espinacas se agroinfiltran manualmente con suspensiones de A.tumefaciens que llevan vectores de expresión recombinante EGFP, y la expresión de proteína fluorescente se visualiza mediante el análisis de manchas occidentales y se cuantifica bajo la luz UV. El sistema de remolacha roja se caracteriza por una mayor expresión de EGFP, alcanzando aproximadamente 544 microgramos por gramo de peso fresco de la hoja a los nueve días después de la infección, mientras que la espinaca sólo alcanzó un nivel máximo de aproximadamente 113,4 microgramos por gramo de peso fresco de la hoja en 11 días después de la infección. Debido a esto, la remolacha roja se selecciona como host de expresión para todos los experimentos posteriores.
Las plantas se infiltran al vacío con una suspensión A.tumefaciens. Después de la extracción de TSP de hojas de agroinfiltración, las muestras son analizadas por Western blot, y la proteína recombinante se cuantifica relativamente mediante un análisis de densitometría. Por último, se evalúan los parámetros para el desarrollo de una posible vacuna oral.
Como se ve aquí, la proteína diana se ve estable después del proceso de liofilización. La digestión gástrica se simula añadiendo la enzima gástrica porcina al material liofilado, ya sea a una concentración final de un miligramo por mililitro, o una relación de uno a 20, a TSP. Ambas condiciones de tratamiento digestivo resultan en la degradación de la proteína recombinante.
La ausencia de una señal específica en las muestras de pellets después de la digestión de la pepsina sugiere que después del secado por congelación, las células de la planta perdieron su integridad, y esto condujo a la degradación de la proteína objetivo. El procedimiento debe adaptarse cuidadosamente a las especies vegetales con respecto a la infiltración al vacío y a la proteína recombinante objetivo con respecto al análisis del curso de tiempo. El procedimiento de demostración también podría utilizarse para la producción de productos biofarmacéuticos destinados a la administración oral, como la vacuna y los anticuerpos.
