В этом протоколе мы демонстрируем, как использовать бесплатный метод жизни c. elegans, чтобы прояснить патогенность, вызванную перекисью водорода, вырабатываемой через стрептококки Mitis Group. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем изучать патогенность и активацию стрессовых реакций в черве, используя устойчивый биологический источник реактивных видов кислорода в отличие от химических источников Для одного литра средств массовой информации добавить 30 г порошка Тодд Хьюитт, 2 г дрожжевого экстракта и 20 г агера до 2 литровой колбы Эрлин Майер.
Добавьте 970 мл деионизированной воды в содержимое колбы и положите в бар для перемешивания. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть отверстие. Автоклав средств массовой информации в колбе при температуре 121 градусов по Цельсию и давление 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
После этого установите колбу на тарелку для перемешивания, чтобы остыть с нежным перемешиванием. Под ламинарный капюшон, залить средства массовой информации в соответствующих размеров, стерильные блюда Петри. Дайте средствам массовой информации высохнуть в течение 2 часов.
После этого хранить пластины при 4 градусах по Цельсию на срок до 1 месяца. Перед приготовлением стрептококков Mitis Group разогреть агарные пластины THY в инкубаторе до 37 градусов по Цельсию. После этого используйте стерильную петлю, чтобы выть желаемые штаммы стрептикоччи на местах.
Затем положить пластины в банку свечи и инкубировать банку при 37 градусов по Цельсию на ночь в течение примерно 18 часов, чтобы обеспечить микроэрофильной среде. На следующий день снимите пластины со свечи и используйте стерильную петлю, чтобы выбрать изолированные колонии. Привить 15 мл стерильных конических трубок, содержащих 2 мл бульона THY.
Закройте крышки плотно и инкубировать трубки при 37 градусах по Цельсию в статических условиях. Предварительно теплые пластины THY в инкубаторе до 37 градусов по Цельсию добавляют 50 микролитров раствора, содержащего 1000 единиц каталазы на пластине THY. Используйте стерильный распространитель для распространения раствора каталазы и дайте пластинам высохнуть на капоте ламинарного потока в течение 30 минут.
Чтобы посеять пластины с штаммами стрептококка, используйте пипетку, чтобы добавить 80 микролитров ночных выращенных культур к пластине и использовать стерильный распространитель для распространения бактерий полностью по всей поверхности агара. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в свече банку на ночь. В качестве контроля, на двух ngM пластин, добавить 80 микролитров ночь выросли культуры E.coli OP-50 для посева.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день снимите пластины со свечи и дайте пластинам остыть до комнатной температуры. Используя стерильный червь забрать, передачи 30 L4 личинок из NGM кормления пластин стрептококк семенами THY пластин.
Инкубировать пластины при 25 градусах по Цельсию. Под рассеченным микроскопом подсчитайте количество живых и мертвых личинок L4 на каждой пластине в несколько точек времени. Используйте стерильный червь выбрать мягко подталкивать червей и определить, если они мертвы или живы.
Первоначально, оценка червей, как мертвые или жить каждые 30 минут. Когда черви быстро начинают умирать, оценка их с интервалом в 15 минут. Анализ займет от 5 до 6 часов.
После этого повторите эксперимент еще два раза. Чтобы подготовить агарозную площадку, придерживайтесь лабтепа вдоль двух стеклянных горок. Это позволит определить толщину агарозы колодки.
Поместите чистую стеклянную горку между двумя лентой слайдов. Растворите агарозу в деионизированной воде, чтобы сделать 2 процента веса и нагреть раствор в микроволновой печи. Используйте пипетку, чтобы разместить 100 микролитров расплавленной агары на центре чистой горки.
Немедленно поместите еще один чистый стеклянный слайд на верхней части расплавленной агарозы и осторожно нажмите вниз, чтобы сделать площадку. Разрешить агарозы затвердеть и впоследствии удалить верхний слайд. Площадка агароза готова к использованию.
Предварительно теплые пластины THY до 37 градусов по Цельсию. Семя пластин с штаммами стрептококка, как это было сделано ранее в анализе выживаемости. Семя 3 NGM пластин с E-coli OP-50 в качестве контроля и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
На следующий день охлади тарелки до комнатной температуры. Используйте буфер M9W для мытья личинок L4 из NGM или NGM РНК кормления пластин в 15 мл конических труб. Спин трубки при 450 раз г, в течение одной минуты в центрифуге.
Декант супернатант и добавить 10 мл M9W к каждой трубке. Повторите центробежный шаг еще три раза. Повторно приостанавливать червей в 250 микролитров M9W и место три 5 микролитров капли червя подвески на чистую крышку чашки Петри.
Под рассеченным микроскопом оцените количество червей на микролитер. Используя пипетку, добавьте около 100 личинок L4 к каждому thy streptococcus seededus и NGM E.coli посеянным пластинам. Используйте три пластины на штамм бактерий.
Инкубировать пластины в течение 2 до 3 часов при 25 градусах по Цельсию. После этого снимите пластины с инкубатора. Вымойте их с M9W и собирать червей в 15 мл конических труб.
Вымойте червей в три раза, как это было сделано ранее в центробежной шаг. Удалите большую часть M9W путем устремления. И добавить 500 микролитров M9W, содержащих 2 миллимолярный азид натрия или тетрамизол гидрохлорид червя гранулы для анестезии.
Инкубировать трубку с червя гранулы при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем уроните 15 микролитров подвески червя на подготовленную агорозную площадку. Под флуоресцентным микроскопом визуализируете локализацию skn-1 с использованием фильтров Fitzy и Dappy.
Изображение червей в 10 раз и 20 раз больше. Оценка червей на основе трех уровней локализации;низкая локализация, где не наблюдается ядерной локализации, средняя локализация, с SKN 1 BCGFP в передней или задней части червя, и высокая локализация, где ядерная локализация skn-1 BCGFP наблюдается во всех кишечных клетках. В этом эксперименте члены группы Mitis быстро убили червей, в отличие от S.mutans, S.salivarius и непатогенных E.coli OP-50.
Когда каталаза была дополнена THY ager, убийство червей было отменено. Смерть червей не наблюдалась на штамме мутантов дельта spxB по сравнению с штаммами дикого типа и комплиментами. Эти данные свидетельствуют о том, что перекись водорода, производимая Mitis Group, является посредником в убийстве червей.
Значительное снижение выживаемости червей нокдауна skn-1 наблюдалось по сравнению с векторным контролем обработанных червей. Аналогичный фенотип убийства наблюдался с штаммом мутантов skn-1 и червями дикого типа N2. Это показывает, что skn-1 влияет на выживание червей на Mitis Group.
Локализация skn-1 BCGFP наблюдалась у червей, подвергшихся воздействию штаммов N-комплиментов дикого типа, а не в ответ на штамм мутантов Delta spxB s cordonae. После того, как компоненты карты P38 киназы пути были сбиты, снижение локализации skn-1 BCGFP и нокдаун обработанных червей, по отношению к вектору контроля обработанных червей, было отмечено. С помощью стрептококков c.
elegans системы, влияние перекиси водорода на эндоплазмический вертикулярный стресс, митохондриальные повреждения, митохогии, и тофогия могут быть дополнительно изучены. Более того, механизмы, с помощью которых перекись водорода действует как фактор вирилесценции, чтобы вызвать иммунные реакции, нарушая основные процессы клетки могут быть определены.
