Dans ce protocole, nous démontrons comment utiliser une méthode de vie libre c. elegans pour élucider la pathogénie causée par le peroxyde d’hydrogène produit par l’intermédiaire des streptocoques du Groupe Mitis. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier la pathogénicité et l’activation des réponses au stress dans le ver en utilisant une source biologique durable d’espèces réactives d’oxygène par opposition aux sources chimiques Pour un litre de médias ajouter 30g de poudre Todd Hewitt, 2g d’extrait de levure et 20g d’ager à un flacon Erlin Myer de 2 litres.
Ajouter 970 ml d’eau déionisée au contenu du flacon et mettre dans une barre d’agitation. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir l’ouverture. Autoclave le média dans le flacon à une température de 121 degrés Celsius et la pression de 15 livres par pouce carré pendant 30 minutes.
Par la suite, mettre le flacon sur une plaque à remuer pour refroidir en remuant doucement. Sous une capuche laminaire, verser les médias dans des boîtes de Petri de taille appropriée et stériles. Laisser sécher les médias pendant 2 heures.
Ensuite, conservez les assiettes à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 mois. Avant la préparation des streptocoques du Groupe Mitis, réchauffer les plaques d’agar THY dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après cela, utilisez une boucle stérile pour strier les souches désirées de streptocoques sur les lieux.
Ensuite, mettez les assiettes dans un bocal à chandelles et couvez le bocal à 37 degrés Celsius pendant une nuit pendant environ 18 heures pour fournir un environnement microérophilique. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et utilisez une boucle stérile pour ramasser les colonies isolées. Inoculer 15 ml de tubes coniques stériles contenant 2 ml de bouillon THY.
Fermez les bouchons serrés et incubez les tubes à 37 degrés Celsius dans des conditions statiques. Les plaques THY préchauffées dans un incubateur à 37 degrés Celsius ajoutent 50 microlitres de solution contenant 1000 unités de catalase sur la plaque THY. Utilisez un épandeur stérile pour étendre la solution catalase et laisser sécher les plaques sur le capot d’écoulement laminaire pendant 30 minutes.
Pour ensemencer les plaques avec les souches de streptocoque, utilisez une pipette pour ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit à la plaque et utilisez un épandeur stérile pour propager complètement les bactéries à travers la surface de l’agar. Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius dans un bocal à chandelles pendant la nuit. À titre de contrôle, sur deux plaques NGM, ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit d’E.coli OP-50 pour l’ensemencement.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et laissez refroidir les assiettes à température ambiante. À l’aide d’un pic de ver stérile, transférer 30 larves de L4 des plaques d’alimentation du MNM vers les plaques THY ensemencées par le streptocoque.
Incuber les plaques à 25 degrés Celsius. Au microscope disséquant, compter le nombre de larves vivantes et mortes de L4 sur chaque plaque à plusieurs moments. Utilisez le pic de ver stérile pour propulser doucement les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants.
Initialement, marquer les vers comme morts ou vivre toutes les 30 minutes. Lorsque les vers commencent rapidement à mourir, marquez-les à intervalles de 15 minutes. L’analyse prendra de 5 à 6 heures.
Après cela, répétez l’expérience deux fois de plus. Pour préparer la garniture d’agarose, collez labtape dans le sens de la longueur le long de deux glissières en verre. Ceci déterminera l’épaisseur des garnitures d’agarose.
Placez une glissière en verre propre entre les deux glissières enregistrées. Dissoudre l’agarose dans l’eau déionisée pour faire 2 pour cent de volume de poids et chauffer la solution dans un four à micro-ondes. Utilisez une pipette pour placer 100 microlitres d’agarose fondue au centre de la glissière propre.
Placez immédiatement une autre glissière en verre propre sur le dessus de l’agarose fondue et appuyez doucement vers le bas pour faire un tampon. Laissez l’agarose se solidifier et retirez ensuite la glissière supérieure. Le tampon agarose est prêt à l’emploi.
Plaques THY préchauffées à 37 degrés Celsius. Ensemencer les assiettes avec une souche de streptocoque comme cela a été fait précédemment dans les analyses de survie. Graine 3 plaques NGM avec E-coli OP-50 comme contrôle et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, refroidir les assiettes à température ambiante. Utilisez le tampon M9W pour laver les larves L4 des plaques d’alimentation NGM ou NGM RNAi en tubes coniques de 15 ml. Faire tourner les tubes à 450 fois g, pendant une minute dans une centrifugeuse.
Décanter le supernatant et ajouter 10 ml de M9W à chaque tube. Répétez l’étape centrifuge trois fois de plus. Suspendre à nouveau les vers dans 250 microlitres de M9W et placer trois gouttes de 5 microlitres de la suspension du ver sur un couvercle de boîte de Pétri propre.
Sous un microscope disséquant, estimer le nombre de vers par microlitre. À l’aide d’une pipette, ajouter environ 100 larves de L4 à chaque streptocoque THY épépiné et plaques ensemencées NGM E.coli. Utilisez trois plaques par souche de bactéries.
Incuber les plaques pendant 2 à 3 heures à 25 degrés Celsius. Par la suite, retirer les assiettes de l’incubateur. Lavez-les avec M9W et recueillez les vers dans des tubes coniques de 15ml.
Lavez les vers trois fois comme cela a été fait précédemment dans l’étape centrifuge. Supprimez la majeure partie du M9W par aspiration. Et ajouter 500 microlitres de M9W contenant 2 millimilliards d’azide de sodium ou hydrochlorure tétramisole à la pastille de ver pour l’anesthésie.
Incuber le tube avec des granulés de ver à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, déposez 15 microlitres de la suspension de ver sur un tampon d’agorose préparé. Au microscope fluorescent, visualisez la localisation des filtres Skn-1 à l’aide de filtres Fitzy et Dappy.
Vers d’image à 10 fois et 20 fois grossissements. Marquer les vers en fonction de trois niveaux de localisation;faible localisation, où aucune localisation nucléaire n’est observée, localisation moyenne, avec SKN 1 BCGFP dans l’antérieur ou postérieur du ver, et localisation élevée, où la localisation nucléaire de skn-1 BCGFP est observée dans toutes les cellules intestinales. Dans cette expérience, les membres du Groupe Mitis ont rapidement tué les vers, par opposition à S.mutans, S.salivarius et non pathogène E.coli OP-50.
Lorsque la catalase a été complétée à THY ager, le meurtre des vers a été aboli. La mort des vers n’a pas été observée sur la souche mutante delta spxB par rapport aux souches de type sauvage et compliment. Ces données suggèrent que le peroxyde d’hydrogène produit par le Groupe Mitis médie l’abattage des vers.
Une diminution significative de la survie des vers knockdown skn-1 a été observée par rapport aux vers traités à la lutte antivectorielle. Un phénotype mortifuge similaire a été observé avec la souche mutante skn-1 et les vers de type sauvage N2. Cela démontre que skn-1 influencer la survie des vers sur le groupe Mitis.
La localisation du SKN-1 BCGFP a été observée chez les vers exposés aux souches de N-compliment de type sauvage et non en réponse à la souche mutante Delta spxB des cordonae S. Après que des composants de la voie de kinase de carte P38 aient été renversés, la localisation réduite du BCGFP skn-1 et des vers traités de knockdown, par rapport aux vers traités de lutte antivectorielle, a été observée. En utilisant le streptocoque c.
système elegans, les effets du peroxyde d’hydrogène sur le stress verticulaire endoplasmique, les dommages mitochondriaux, la mitophogie et la tophogie peuvent être étudiés plus avant. En outre, les mécanismes par lesquels le peroxyde d’hydrogène agit comme un facteur de virilescence pour obtenir des réponses immunitaires en perturbant les processus de base de la cellule peuvent être identifiés.
