Bu protokolde, Mitis Grubu streptokokları ile üretilen hidrojen peroksitin neden olduğu patojeniteyi açıklamak için c. elegans'ın serbest yaşam yönteminin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin ana avantajı biz patojenite ve reaktif oksijen türlerinin sürdürülebilir bir biyolojik kaynak kullanarak solucan stres yanıtlarının aktivasyon çalışabilirsiniz kimyasal kaynaklaryerine bir litre medya todd Hewitt tozu 30g eklemek için, maya özü 2g ve 2 litre lik Erlin Myer şişesi ne ager 20g.
Şişenin içeriğine 970ml deiyonize su ekleyin ve bir karıştırma çubuğuna koyun. Açıklığı kapatmak için alüminyum folyo kullanın. Otoklav 121 santigrat derece sıcaklıkta şişede medya ve 30 dakika boyunca inç kare başına 15 pound basınç.
Daha sonra hafif karıştırma ile soğuması için bir karıştırma plakası üzerinde şişe ayarlayın. Bir laminar başlık altında, uygun büyüklükte, steril Petri yemekleri içine medya dökün. Ortamın 2 saat kurumasını bekleyin.
Daha sonra plakaları 4 santigrat derecede 1 aya kadar saklayın. Mitis Group streptokokları hazırlanmadan önce THY agar plakalarını 37 santigrat dereceye kadar kuvözde ısıtın. Bundan sonra yerlerde strepticocci istenilen suşları dışarı çizgi steril bir döngü kullanın.
Sonra bir mum kavanozuna plakaları koyun ve mikroerofilik bir ortam sağlamak için yaklaşık 18 saat boyunca bir gecede 37 derece santigrat kavanoz kuluçka. Ertesi gün, mum kavanozundan plakaları çıkarın ve izole kolonileri almak için steril bir döngü kullanın. 2 ml THY suyu içeren 15 ml steril konik tüplerin aşıla.
Kapakları sıkıca kapatın ve statik koşullar altında tüpleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. 37 dereceye kadar bir kuluçka makinesinde önceden ısınmış THY plakaları, THY plakasına 1000 ünite katalaz içeren 50 mikrolitre çözelti ekler. Katalaz çözeltisini yaymak için steril bir dağıtıcı kullanın ve plakaların laminar akış kaputunda 30 dakika kurumasını bekleyin.
Streptokok suşları ile plaka tohum için, plaka ya da tamamen agar yüzeyinde bakteri yaymak için steril bir yayıcı kullanmak için plaka bir gecede yetiştirilen kültürlerin 80 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Tabakları bir gecede mum kavanozuna 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bir kontrol olarak, iki NGM plakaları üzerinde, tohumlama için E.coli OP-50 gecede yetiştirilen kültürlerin 80 mikrolitre ekleyin.
Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mum kavanozundaki tabakları çıkarın ve tabakların oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Steril solucan toplama kullanarak, NGM besleme plakalarından streptokok tohumlu THY plakalarına 30 L4 larva aktarın.
Plakaları 25 derecede kuluçkaya yatırın. Bir diseksiyon mikroskop altında, birkaç zaman noktalarında her plaka üzerinde canlı ve ölü L4 larvasayısını saymak. Solucanları nazikçe dürtmek ve ölü ya da canlı olup olmadığını belirlemek için steril solucan almak kullanın.
Başlangıçta, ölü olarak solucanlar puan veya her 30 dakikada bir canlı. Solucanlar hızla ölmeye başladığında, onları 15 dakikalık aralıklarla puanlayın. Tsanın tamamlanması 5 ila 6 saat sürer.
Bundan sonra, denemeyi iki kez daha tekrarlayın. Agarose ped hazırlamak için, iki cam slaytlar boyunca uzunlamasına labtape sopa. Bu agarose pedleri kalınlığını belirleyecektir.
Bantlanmış iki slayt arasına temiz bir cam slayt yerleştirin. 2 ağırlık hacmi yüzde yapmak ve bir mikrodalga çözelti ısı deiyonize suda agarose çözünür. Temiz kaydırağın ortasına 100 mikrolitre erimiş agarose yerleştirmek için bir pipet kullanın.
Hemen erimiş agarose üstüne başka bir temiz cam slayt yerleştirin ve yavaşça bir yastık yapmak için aşağı basın. Agarose'un katılaştırılmasına ve daha sonra üst teki slaydı kaldırmasına izin verin. Agarose ped kullanıma hazırdır.
37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılatan THY plakaları. Hayatta kalma tahlillerinde daha önce yapıldığı gibi bir streptokok suşları ile tohum plakaları. Kontrol ve bir gecede 37 derece santigrat inkübat olarak E-coli OP-50 ile Tohum 3 NGM plakaları.
Ertesi gün tabakları oda sıcaklığına kadar soğutun. 15 ml konik tüpler içine NGM veya NGM RNAi besleme plakaları L4 larvayıkamak için M9W tampon kullanın. Tüpleri 450 kez g'de döndürün, bir dakika lığına santrifüjde.
Supernatant decant ve her tüp için M9W 10 ml ekleyin. Santrifüj basamanı üç kez daha tekrarlayın. Solucanları 250 mikrolitre M9W'da yeniden askıya alın ve solucan süspansiyonunun üç 5 mikrolitre damlasını temiz bir Petri kabının kapağına yerleştirin.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, mikrolitre başına solucan sayısını tahmin edin. Bir pipet kullanarak, her THY streptokok tohumu ve NGM E.coli tohumlu plakalar yaklaşık 100 L4 larva ekleyin. Bakteri suşu başına üç tabak kullanın.
Plakaları 2-3 saat 25 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kuvözden plakaları çıkarın. M9W ile yıkayın ve 15ml konik tüpler solucanlar toplamak.
Solucanları santrifüj adımda daha önce yaptığı gibi üç kez yıkayın. Aspirasyon ile M9W'nin çoğunu çıkarın. Ve anestezi için solucan pelet ine 2 milimolar sodyum azit veya tetramisole hidroklorür içeren 500 mikrolitre M9W ekleyin.
15 dakika boyunca oda sıcaklığında solucan pelet leri ile tüp kuluçka. Daha sonra, hazır bir agorose ped üzerine solucan süspansiyon 15 mikrolitre bırakın. Floresan mikroskop altında, Fitzy ve Dappy filtreleri kullanan skn-1'in lokalizasyonunu görselleştirin.
Görüntü solucanları 10 kat ve 20 kat büyütme. Solucanları üç yerelleştirme düzeyine göre puankazanın;nükleer lokalizasyonun gözlenmediği düşük lokalizasyon, orta lokalizasyon, solucanın ön veya arka kısmında SKN 1 BCGFP ve tüm bağırsak hücrelerinde skn-1 BCGFP'nin nükleer lokalizasyonunun gözlendiği yüksek lokalizasyon. Bu deneyde, Mitis Grubu üyeleri hızla, S.mutans, S.salivarius ve patojen olmayan E.coli OP-50 aksine solucanlar öldürdü.
Katalaz THY'ye takviye edildiğinde solucanların öldürülmesi kaldırıldı. Solucanların ölümü, delta spxB mutant suşunda yabani tip ve iltifat suşlarına göre gözlenmedi. Bu veriler, Mitis Grubu tarafından üretilen hidrojen peroksitin solucanların öldürülmesine aracılık ettiğini göstermektedir.
Skn-1 nakavt solucanlarının hayatta kalmalarında vektör kontrolü tedavi edilen solucanlara göre önemli bir azalma gözlenmiştir. Benzer bir öldürme fenotip skn-1 mutant suşu ve N2 vahşi tip solucanlar ile gözlendi. Bu, SKN-1'in solucanların Mitis Grubu'ndaki hayatta kalmasını etkilediğini göstermektedir.
Skn-1 BCGFP lokalizasyonu, S cordonae'nin Delta spxB mutant türüne yanıt olarak değil, yabani tip N-iltifat suşlarına maruz kalan solucanlarda gözlendi. P38 harita kinaz yolunun bileşenleri yıkıldıktan sonra, skn-1 BCGFP'nin lokalizasyonu azaltıldı ve vektör kontrolü tedavi edilen solucanlara göre nakavt işlenmiş solucanlar gözlendi. Streptokok c kullanarak.
elegans sistemi, endokrinazmik vertiküler stres hidrojen peroksit etkileri, mitokondriyal hasar, mitopgoli, ve topgogoya daha fazla incelenebilir. Ayrıca, hidrojen peroksit hücrenin çekirdek süreçlerini bozarak bağışıklık yanıtları ortaya çıkarmak için bir erkeksi faktör olarak hareket mekanizmaları tespit edilebilir.
