En este protocolo demostramos cómo utilizar un método de vida libre c. elegans para dilucidar la patoxíxito causada por peróxido de hidrógeno producido a través de estreptococos del Grupo Mitis. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la patogenicidad y la activación de las respuestas al estrés en el gusano mediante el uso de una fuente biológica sostenible de especies reactivas de oxígeno en comparación con las fuentes químicas Para un litro de medios añadir 30g de polvo Todd Hewitt, 2g de extracto de levadura y 20g de ager a un matraz Erlin Myer de 2 litros.
Añadir 970ml de agua desionizada al contenido del matraz y poner en una barra de agitación. Utilice papel de aluminio para cubrir la abertura. Autoclave el medio en el matraz a una temperatura de 121 grados Celsius y presión de 15 libras por pulgada cuadrada durante 30 minutos.
A continuación, ajuste el matraz en una placa de agitación para que se enfríe con una agitación suave. Bajo una capucha laminar, vierta los medios en platos Petri estériles y de tamaño adecuado. Deje que el soporte se seque durante 2 horas.
A partir de entonces guarde las placas a 4 grados centígrados durante un máximo de 1 mes. Antes de la preparación de los estreptococos del Grupo Mitis, caliente las placas de agar THY en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de que utilice un bucle estéril para rayar las cepas deseadas de estrepticocci en los lugares.
A continuación, coloque las placas en un frasco de velas e incubar el frasco a 37 grados centígrados durante unas 18 horas para proporcionar un ambiente microerofílico. Al día siguiente, retire las placas del frasco de velas y use un bucle estéril para recoger colonias aisladas. Inocular tubos cónicos estériles de 15 ml que contengan 2 ml de caldo THY.
Cierre las tapas apretadas e incubar los tubos a 37 grados centígrados en condiciones estáticas. Precaliente thy placas en una incubadora a 37 grados Celsius añadir 50 microlitros de solución que contienen 1000 unidades de catalasa en la placa THY. Utilice un esparcidor estéril para esparcir la solución de catalasa y dejar que las placas se sequen en la campana de flujo laminar durante 30 minutos.
Para sembrar las placas con las cepas de estreptococo, utilice una pipeta para agregar 80 microlitros de cultivos cultivados durante la noche a la placa y utilice un esparcidor estéril para esparcir las bacterias por completo a través de la superficie del agar. Incubar las placas a 37 grados centígrados en un frasco de velas durante la noche. Como control, en dos placas NGM, agregue 80 microlitros de cultivos cultivados durante la noche de E.coli OP-50 para la siembra.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire las placas del frasco de velas y deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente. Usando un pico de gusano estéril, transfiera 30 larvas L4 de las placas de alimentación NGM a las placas THY sembradas de estreptococo.
Incubar las placas a 25 grados centígrados. Bajo un microscopio de disección, cuente el número de larvas L4 vivas y muertas en cada placa en varios puntos de tiempo. Utilice el pico de gusano estéril para prod suavemente los gusanos y determinar si están vivos o muertos.
Inicialmente, anota los gusanos como muertos o vive cada 30 minutos. Cuando los gusanos comiencen a morir rápidamente, puntúelos a intervalos de 15 minutos. El ensayo tardará de 5 a 6 horas en completarse.
Después de eso, repita el experimento dos veces más. Para preparar la almohadilla de agarosa, pegue labtape a lo largo de dos toboganes de vidrio. Esto determinará el grosor de las almohadillas de agarosa.
Coloque una corredera de vidrio limpia entre las dos diapositivas grabadas. Disolver la agarosa en agua desionizada para hacer 2 por ciento de volumen de peso y calentar la solución en un microondas. Utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de agarosa fundida en el centro de la corredera limpia.
Coloque inmediatamente otro portaobjetos de vidrio limpio en la parte superior de la agarosa fundida y presione suavemente hacia abajo para hacer una almohadilla. Permita que la agarosa se solidifique y posteriormente retire la corredera superior. La almohadilla de agarosa está lista para su uso.
Precalece las placas THY a 37 grados centígrados. Siembra las placas con cepas de estreptococo como se hacía anteriormente en los ensayos de supervivencia. Semilla 3 placas NGM con E-coli OP-50 como control e incubación a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, enfríe las placas a temperatura ambiente. Utilice Tampón M9W para lavar larvas L4 de placas de alimentación NGM o NGM RNAi en tubos cónicos de 15 ml. Gire los tubos a 450 veces g, durante un minuto en una centrífuga.
Decantar el sobrenadante y añadir 10 ml de M9W a cada tubo. Repita el paso centrífugo tres veces más. Vuelva a suspender los gusanos en 250 microlitros de M9W y coloque tres gotas de 5 microlitros de la suspensión del gusano en una tapa limpia de la placa Petri.
Bajo un microscopio de disección, estime el número de gusanos por microlitro. Con una pipeta, agregue aproximadamente 100 larvas L4 a cada sembrado de estreptococo THY y placas de semillas NGM E.coli. Use tres placas por cepa de bacterias.
Incubar las placas durante 2 a 3 horas a 25 grados centígrados. A continuación, retire las placas de la incubadora. Lávelos con M9W y recoja los gusanos en tubos cónicos de 15 ml.
Lavar los gusanos tres veces como se hizo anteriormente en el paso centrífugo. Retire la mayor parte del M9W por aspiración. Y añadir 500 microlitros de M9W que contengan 2 alacidios sódicos mili evolucionadores o clorhidrato de tetramisole al pellet de gusano para la anestesia.
Incubar el tubo con pellets de gusano a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, suelte 15 microlitros de la suspensión del gusano en una almohadilla de agorose preparada. Bajo un microscopio fluorescente, visualice la localización de skn-1 utilizando filtros Fitzy y Dappy.
Imagen de gusanos a 10 veces y 20 veces aumentos. Puntuar los gusanos en función de tres niveles de localización;baja localización, donde no se observa ninguna localización nuclear, localización media, con SKN 1 BCGFP en el anterior o posterior del gusano, y alta localización, donde se observa la localización nuclear de skn-1 BCGFP en todas las células intestinales. En este experimento, los miembros del Grupo Mitis mataron rápidamente a los gusanos, a diferencia de S.mutans, S.salivarius y E.coli OP-50 no patógenos.
Cuando la catalasa se complementó con THY ager, el asesinato de los gusanos fue abolido. No se observó la muerte de los gusanos en la cepa mutante delta spxB en comparación con las cepas de tipo salvaje y de cortesía. Estos datos sugieren que el peróxido de hidrógeno producido por el Grupo Mitis media la muerte de los gusanos.
Se observó una disminución significativa en la supervivencia de los gusanos knockdown skn-1 en comparación con los gusanos tratados con control vectorial. Se observó un fenotipo de matanza similar con la cepa mutante skn-1 y los gusanos de tipo salvaje N2. Esto demuestra que el skn-1 influye en la supervivencia de los gusanos en el Grupo Mitis.
Se observó la localización de skn-1 BCGFP en gusanos expuestos a las cepas de tipo salvaje N-compliment y no en respuesta a la cepa mutante Delta spxB de la S cordonae. Después de que los componentes de la vía de la quinasa del mapa P38 fueron derribados, se observó una menor localización de skn-1 BCGFP y gusanos tratados con derribo, en relación con los gusanos tratados con control vectorial. Mediante el uso de los estreptococos c.
sistema de elegans, los efectos del peróxido de hidrógeno en el estrés verticular endoplasmático, daño mitocondrial, mitofogia, y tophogy se pueden estudiar más a fondo. Además, se pueden identificar mecanismos por los cuales el peróxido de hidrógeno actúa como un factor de virilidad para obtener respuestas inmunitarias al interrumpir los procesos centrales de la célula.
