בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשתמש בשיטת חיים חופשית c. elegans כדי להבהר את הפתוגניות הנגרמת על ידי מי חמצן המיוצר באמצעות סטרפטוקוצ'י קבוצת Mitis. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים ללמוד פתוגניות והפעלת תגובות מתח בתולעת באמצעות מקור ביולוגי בר קיימא של מיני חמצן תגובתי לעומת מקורות כימיים עבור ליטר אחד של מדיה להוסיף 30 גרם של אבקת טוד יואיט, 2 גרם של תמצית שמרים ו 20 גרם של אגר לבקבוק 2 ליטר Erlin מאייר.
מוסיפים 970 מ"ל של מים deionized לתוכן של הבקבוק ולשים בבר מערבבים. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את הפתח. Autoclave את התקשורת בבקבוק בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 15 פאונד לאינץ 'מרובע במשך 30 דקות.
לאחר מכן מניחים את הבקבוק על צלחת ערבוב כדי להתקרר עם ערבוב עדין. מתחת למכסה המנוע, יוצקים את המדיה למנות פטרי סטריליות בגודל הולם. אפשר לתקשורת להתייבש במשך שעתיים.
לאחר מכן לאחסן את הצלחות ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש. לפני הכנת סטרפטוקוצ'י קבוצת Mitis, לחמם את צלחות אגר THY באינקובטור ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בלולאה סטרילית כדי לפסים את הזנים הרצויים של סטרפטיקוצ'י על המקומות.
ואז לשים את הצלחות בצנצנת נרות דגירה הצנצנת ב 37 מעלות צלזיוס לילה במשך כ 18 שעות כדי לספק סביבה מיקרורופילית. למחרת, להסיר את הצלחות מן צנצנת הנרות ולהשתמש בלולאה סטרילית כדי לבחור מושבות מבודדות. לחסן 15 מ"ל צינורות חרוט סטרילי המכיל 2 מ"ל של מרק THY.
סוגרים את הכובעים בחוזקה ומודרים את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים. צלחות THY טרום חמימות באינקובטור ל-37 מעלות צלזיוס מוסיפות 50 מיקרוליטרים של פתרון המכילים 1000 יחידות של קטלאז לצלחת THY. השתמש מפזר סטרילי כדי להפיץ את פתרון קטלאז ולאפשר את הצלחות להתייבש על מכסה המנוע לזרום למינאר במשך 30 דקות.
כדי לזרוע את הצלחות עם זני סטרפטוקוקוס, השתמש פיפטה להוסיף 80 microliters של תרבויות לילה גדל לצלחת ולהשתמש מפזר סטרילי כדי להפיץ את החיידקים לחלוטין על פני השטח אגר. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס בצנצנת נרות לילה. כפקד, על שתי צלחות NGM, להוסיף 80 microliters של תרבויות לילה גדל של E.coli OP-50 עבור זריעה.
דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להסיר את הצלחות מצנצנת הנרות ולאפשר את הצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר. באמצעות פיק תולעת סטרילי, להעביר 30 זחלים L4 מצלחות האכלה NGM לצלחות ת'י זרעי סטרפטוקוקוס.
הדגירה את הצלחות ב 25 מעלות צלזיוס. תחת מיקרוסקופ לנתח, לספור את מספר זחלי L4 חיים ומתים על כל צלחת בכמה נקודות זמן. השתמשו בבחירה של התולעים הסטריליות כדי לדרבן בעדינות את התולעים ולקבוע אם הן חיות או מתות.
בתחילה, להבקיע את התולעים כמתים או לחיות כל 30 דקות. כאשר תולעים מתחילות למות במהירות, ציון אותם במרווחים של 15 דקות. ההתדאגה תימשך 5 עד 6 שעות.
לאחר מכן, חזור על הניסוי פעמיים נוספות. כדי להכין את כרית agarose, מקל labtape לאורך לאורך שתי שקופיות זכוכית. זה יקבע את עובי רפידות אגרוז.
מקם שקופית זכוכית נקייה בין שתי השקופיות המודבקות. ממיסים התעוררו במים deionized כדי להפוך 2 אחוז נפח משקל לחמם את הפתרון במיקרוגל. השתמש פיפטה למקם 100 microliters של אגת מותכת על מרכז השקופית הנקייה.
מיד מניחים עוד מגלשת זכוכית נקייה על גבי אגרוז מותך בעדינות לחץ למטה כדי להפוך כרית. אפשר לתעוררות להתגבש ולאחר מכן להסיר את השקופית העליונה. כרית אגרוז מוכנה לשימוש.
צלחות THY טרום חום ל 37 מעלות צלזיוס. זרע את הצלחות עם זני סטרפטוקוקוס כפי שנעשה בעבר בהישרדות. זרעים 3 צלחות NGM עם E-coli OP-50 כבקרה ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, לקרר את הצלחות לטמפרטורת החדר. השתמשו במאגר M9W לשטיפת זחלי L4 מצלחות הזנה של NGM או NGM RNAi לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל. לסובב את הצינורות ב 450 פעמים g, במשך דקה אחת בצנטריפוגה.
תפענחו את העל-טבעי ותוסיפו 10 מ"ל של M9W לכל צינור. חזור על הצעד הצנטריפוגלי שלוש פעמים נוספות. להשעות מחדש את התולעים ב 250 microliters של M9W ולה מניחים שלוש 5 טיפות microliter של ההשעיה תולעת על מכסה צלחת פטרי נקי.
תחת מיקרוסקופ לנתח, להעריך את מספר התולעים לכל microliter. באמצעות פיפטה, להוסיף כ 100 L4 זחלים לכל זרע סטרפטוקוקוס THY ו NGM E.coli זרע צלחות. השתמש שלוש צלחות לכל זן של חיידקים.
הדגירה את הצלחות במשך 2 עד 3 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את הצלחות מהחמה. לשטוף אותם עם M9W ולאסוף את התולעים בצינורות חרוט 15 מ"ל.
לשטוף את התולעים שלוש פעמים כפי שנעשה בעבר בשלב הצנטריפוגלי. הסר את רוב M9W על ידי שאיפה. ולהוסיף 500 microliters של M9W המכיל 2 מילימולר נתרן אזיד או הידרוכלוריד tetramisole לכדור התולעת עבור הרדמה.
הדגירה את הצינור עם כדורי תולעת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, זרוק 15 microliters של ההשעיה תולעת על כרית אגורוז מוכן. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לדמיין את לוקליזציה של skn-1 ניצול פייסי ומסנן דאפי.
תולעי תמונה בהגדלות פי 10 ו-20. ציון התולעים בהתבסס על שלוש רמות של לוקליזציה;לוקליזציה נמוכה, שם לא נצפתה לוקליזציה גרעינית, לוקליזציה בינונית, עם SKN 1 BCGFP בחלק האחורי או האחורי של התולעת, ולוקליזציה גבוהה, שם לוקליזציה גרעינית של skn-1 BCGFP נצפתה בכל תאי המעי. בניסוי זה, חברי קבוצת Mitis הרגו במהירות את התולעים, בניגוד ל- S.mutans, S.salivarius ו- E.coli OP-50 שאינם פתוגניים.
כאשר קטלאז תוסף ל- THY ager, הריגת התולעים בוטלה. מותם של התולעים לא נצפה על זן המוטנטים דלתא spxB בהשוואה לזנים מסוג פראי ומחמאה. נתונים אלה מצביעים על כך שהמי חמצן המיוצר על ידי קבוצת Mitis מתווך הרג של התולעים.
ירידה משמעותית בהישרדות של תולעי נוקאאוט skn-1 נצפתה בהשוואה לשליטה הווקטורית תולעים מטופלות. פנוטיפ הרג דומה נצפה עם זן המוטנטים skn-1 ותולעים מסוג N2. זה מדגים כי skn-1 להשפיע על ההישרדות של התולעים על קבוצת Mitis.
לוקליזציה של skn-1 BCGFP נצפתה בתולעים שנחשפו לזני N-מחמאה מסוג פראי ולא בתגובה לזן המוטנטים דלתא spxB של קורדונה S. לאחר רכיבים של מסלול קינאז מפת P38 הופלו, לוקליזציה מופחתת של skn-1 BCGFP ותולעים מטופלות נוקאאוט, יחסית לשליטה וקטורית תולעים מטופלות, נצפתה. על ידי שימוש בסטרפטוקוצ'י ג.
מערכת אלגנס, ההשפעות של מי חמצן על מתח חוליות אנדופלזמי, נזק מיטוכונדריאלי, מיטופופיה, ו tophogy ניתן ללמוד עוד יותר. יתר על כן, ניתן לזהות מנגנונים שבהם מי חמצן פועל כגורם גברי כדי לגרום לתגובות חיסוניות על ידי שיבוש תהליכי הליבה של התא.
