Neste protocolo demonstramos como usar um método de vida livre c. elegans para elucidar a patogenicidade causada pelo peróxido de hidrogênio produzido através de estreptococos do Grupo Mitis. A principal vantagem desta técnica é que podemos estudar a patogenicidade e a ativação das respostas ao estresse no verme usando uma fonte biológica sustentável de espécies de oxigênio reativo em oposição a fontes químicas Para um litro de mídia adicionar 30g de pó todd hewitt, 2g de extrato de levedura e 20g de ager a um frasco Erlin Myer de 2 litros.
Adicione 970ml de água deionizada ao conteúdo do frasco e coloque em uma barra de mexida. Use papel alumínio para cobrir a abertura. Autoclave a mídia no frasco a uma temperatura de 121 graus Celsius e pressão de 15 libras por polegada quadrada por 30 minutos.
Depois disso, coloque o frasco em uma placa de agitação para esfriar com agitação suave. Sob um capô laminar, despeje a mídia em pratos petri apropriadamente dimensionados e estéreis. Deixe a mídia secar por 2 horas.
Depois disso, guarde as placas a 4 graus Celsius por até 1 mês. Antes da preparação do Grupo Mitis streptococci, aqueça as placas de ágar thy em uma incubadora a 37 graus Celsius. Depois disso, use um laço estéril para exatar as cepas desejadas de estrepticocci nos locais.
Em seguida, coloque as placas em um frasco de vela e incubar o frasco a 37 graus Celsius durante a noite por cerca de 18 horas para fornecer um ambiente microerófilo. No dia seguinte, remova as placas do frasco de velas e use um laço estéril para escolher colônias isoladas. Inocular tubos cônicos estéreis de 15 ml contendo 2 ml de caldo THY.
Feche as tampas apertadas e incubar os tubos a 37 graus Celsius em condições estáticas. Placas de THY pré-aquecidas em uma incubadora a 37 graus Celsius adicionam 50 microliters de solução contendo 1000 unidades de catalase na placa THY. Use um espalhador estéril para espalhar a solução de catalase e deixe as placas secarem na coifa de fluxo laminar por 30 minutos.
Para semear as placas com as cepas de estreptococos, use uma pipeta para adicionar 80 microliters de culturas cultivadas durante a noite à placa e use um espalhador estéril para espalhar as bactérias completamente pela superfície do ágar. Incubar as placas a 37 graus Celsius em um frasco de velas durante a noite. Como controle, em duas placas de NGM, adicione 80 microliters de culturas cultivadas durante a noite de E.coli OP-50 para semeadura.
Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire as placas do frasco de velas e deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente. Usando uma picareta de vermes estéril, transfira 30 larvas L4 das placas de alimentação do NGM para as placas de TEU semeadas de estreptococos.
Incubar as placas a 25 graus Celsius. Sob um microscópio dissecando, conte o número de larvas L4 vivas e mortas em cada placa em vários pontos de tempo. Use a picareta de vermes estéreis para gentilmente cutucar os vermes e determinar se eles estão vivos ou mortos.
Inicialmente, marque os vermes como mortos ou viva a cada 30 minutos. Quando os vermes começarem a morrer rapidamente, marque-os em intervalos de 15 minutos. O ensaio levará de 5 a 6 horas para ser concluído.
Depois disso, repita o experimento mais duas vezes. Para preparar a almofada de agarose, coloque o labtape longitudinalmente ao longo de duas lâminas de vidro. Isso determinará a espessura das almofadas agarose.
Coloque um deslizamento de vidro limpo entre os dois slides colados. Dissolver agarose em água deionizada para fazer 2 por cento de volume de peso e aquecer a solução em um micro-ondas. Use uma pipeta para colocar 100 microliters de agarose derretida no centro do escorregador limpo.
Coloque imediatamente outro deslizamento de vidro limpo em cima da agarose derretida e pressione suavemente para baixo para fazer uma almofada. Deixe que a agarose solidifique e, posteriormente, remova o slide superior. A almofada de agarose está pronta para uso.
Placas thy pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Semente as placas com um estreptococos cepas como feito anteriormente nos ensaios de sobrevivência. Semente 3 placas de NGM com E-coli OP-50 como controle e incubação a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, esfrie as placas à temperatura ambiente. Use tampão M9W para lavar larvas L4 de placas de alimentação NGM ou NGM RNAi em tubos cônicos de 15 ml. Gire os tubos a 450 vezes g, por um minuto em uma centrífuga.
Decante o supernasal e adicione 10 ml de M9W a cada tubo. Repita o passo centrífuga mais três vezes. Suspenda os vermes em 250 microlitadores de M9W e coloque três gotas de 5 microliteres da suspensão do verme em uma tampa limpa de placa de Petri.
Sob um microscópio dissecando, estimar o número de vermes por microliter. Usando uma pipeta, adicione aproximadamente 100 larvas L4 a cada estreptococos de TE THY semeadas e placas semeadas NGM E.coli. Use três placas por cepa de bactérias.
Incubar as placas por 2 a 3 horas a 25 graus Celsius. Depois disso, remova as placas da incubadora. Lave-os com M9W e colete os vermes em tubos cônicos de 15ml.
Lave os vermes três vezes mais do que antes na etapa centrífuga. Remova a maior parte do M9W por aspiração. E adicione 500 microlitres de M9W contendo 2 milimônios de azida de sódio ou cloridrato de tetramisole à pelota de verme para anestesia.
Incubar o tubo com pelotas de vermes em temperatura ambiente por 15 minutos. Então, solte 15 microliters da suspensão do verme em uma almofada de agorose preparada. Sob um microscópio fluorescente, visualize a localização dos filtros Skn-1 utilizando filtros Fitzy e Dappy.
Vermes de imagem em 10 vezes e 20 vezes ampliações. Escore os vermes com base em três níveis de localização;baixa localização, onde não é observada localização nuclear, localização média, com SKN 1 BCGFP no anterior ou posterior do verme, e alta localização, onde a localização nuclear de skn-1 BCGFP é observada em todas as células intestinais. Neste experimento, membros do Grupo Mitis rapidamente mataram os vermes, ao contrário de S.mutans, S.salivarius e E.coli OP-50 não patogênicos.
Quando a catalase foi suplementada à THY ager, a morte dos vermes foi abolida. A morte dos vermes não foi observada na cepa mutante delta spxB em comparação com as cepas de tipo selvagem e elogios. Esses dados sugerem que o peróxido de hidrogênio produzido pelo Grupo Mitis media a morte dos vermes.
Observou-se uma diminuição significativa na sobrevivência dos vermes knockdown skn-1 em comparação com os vermes tratados pelo controle vetorial. Um fenótipo de morte semelhante foi observado com a cepa mutante skn-1 e os vermes do tipo selvagem N2. Isso demonstra que o skn-1 influencia a sobrevivência dos vermes no Grupo Mitis.
A localização do skn-1 BCGFP foi observada em vermes expostos às cepas de n-compliment do tipo selvagem e não em resposta à cepa mutante Delta spxB do S cordonae. Depois que componentes da via de quinase do mapa P38 foram derrubados, observou-se a localização reduzida de vermes tratados skn-1 BCGFP e knockdown, em relação aos vermes tratados com controle vetorial. Usando o estreptococo c.
sistema elegans, os efeitos do peróxido de hidrogênio no estresse verticular endoplasmica, dano mitocondrial, mitoforgia e tophogia podem ser estudados. Além disso, podem ser identificados mecanismos pelos quais o peróxido de hidrogênio atua como fator de viriecência para obter respostas imunes, interrompendo os processos centrais da célula.
