이 프로토콜에서 우리는 미티스 그룹 연쇄상 구균을 통해 생성된 과산화수소에 의한 병원성을 해명하기 위해 무료 생활 방법 c. elegans를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 화학 소스와 반대로 반응성 산소 종의 지속 가능한 생물학적 소스를 사용하여 벌레의 병원성과 스트레스 반응의 활성화를 연구 할 수 있다는 것입니다 메디 휴트 분말 의 30g, 효모 추출물 2g과 20g의 에이거2 리터 에를.
플라스크의 내용물에 970ml의 탈이온된 물을 넣고 저어줄에 넣습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 개구부를 덮습니다. 121도의 온도에서 플라스크에서 미디어를 오토클레이브하고 30 분 동안 평방 인치 당 15 파운드의 압력.
그 후 부드러운 교반으로 식히기 위해 교반 접시에 플라스크를 설정합니다. 라미나르 후드 아래에 미디어를 적절히 크기로 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 미디어를 2시간 동안 건조시키십시오.
그 후 최대 1 개월 동안 섭씨 4도에 접시를 저장합니다. 미티스 그룹 연쇄상 구균의 준비 전에, 37섭씨에 인큐베이터에 THY 한천 판을 따뜻하게. 그 후 장소에 strepticocci의 원하는 긴장을 줄무늬멸 루프를 사용합니다.
그런 다음 양초 항아리에 접시를 넣고 약 18 시간 동안 밤새 섭씨 37도에서 항아리를 배양하여 미세 한 환경을 제공합니다. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 고립 된 식민지를 선택하는 멸균 루프를 사용합니다. THY 국물 2ml를 함유한 멸균 원추형 튜브 15ml를 접종합니다.
캡을 단단히 닫고 정적 조건에서 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 인큐베이터에서 37도까지 미리 따뜻하게 하는 THY 플레이트는 1000단위의 카탈라아제를 함유한 50마이크로리터의 용액을 THY 플레이트에 추가합니다. 멸균 스프레더를 사용하여 카탈라제 용액을 확산시키고 플레이트가 라미나르 플로우 후드에서 30분 동안 건조되도록 합니다.
연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드하려면 파이펫을 사용하여 하룻밤 재배 배양 80 마이크로 리터를 접시에 추가하고 멸균 스프레더를 사용하여 식기 표면에 박테리아를 완전히 퍼뜨리습니다. 하룻밤 사이에 촛불 항아리에 37도에서 접시를 배양하십시오. 대조군으로, 두 NGM 플레이트에, 종종에 대한 E.coli OP-50의 하룻밤 재배 문화의 80 마이크로 리터를 추가합니다.
하룻밤 사이에 37도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 접시가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 NGM 급식 플레이트에서 30 L4 애벌레를 연쇄상 구균 시드 THY 플레이트로 옮길 수 있습니다.
섭씨 25도에서 접시를 배양하십시오. 해부 현미경에서, 여러 시간 지점에서 각 접시에 살아있는 L4 애벌레의 수를 계산합니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 웜을 부드럽게 프로딩하고 죽었는지 살아 있는지 확인합니다.
처음에 벌레를 죽은 것으로 채점하거나 30분마다 살 수 있습니다. 벌레가 빠르게 죽기 시작하면 15 분 간격으로 점수를 매습니다. 분석이 완료되는 데 5~6시간이 소요됩니다.
그 후 실험을 두 번 더 반복합니다. 아가로즈 패드를 준비하려면 두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프를 세로로 붙입니다. 이렇게 하면 아가로즈 패드의 두께가 결정됩니다.
두 개의 녹화된 슬라이드 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 아가로즈를 탈온화된 물에 녹여 체중 2%를 만들고 전자레인지에서 용액을 가열합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 용융 아가로즈를 깨끗한 슬라이드 의 중앙에 놓습니다.
즉시 용융 아가로즈 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 부드럽게 아래로 눌러 패드를 만듭니다. 아가로즈가 고체화되고 그 후 상단 슬라이드를 제거하도록 허용합니다. 아가로즈 패드는 사용할 준비가 되어 있습니다.
37섭씨까지 미리 따뜻합니다. 생존 성 약에서 이전에 수행 된 바와 같이 연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드. 종자 3 NGM 플레이트 E-coli OP-50 제어 및 하룻밤 섭씨 37도에서 배양.
다음 날, 실온으로 접시를 식힙니다. M9W 버퍼를 사용하여 NGM 또는 NGM RNAi 급식 플레이트에서 L4 애벌레를 15ml 원추형 튜브로 세척하십시오. 원심분리기에서 1분 동안 튜브를 450배 g로 회전시합니다.
상류제를 데칭하고 각 튜브에 10ml의 M9W를 추가합니다. 원심 단계를 세 번 더 반복합니다. M9W의 250 마이크로리터에서 웜을 다시 중단하고 벌레 서스펜션 35방울을 깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다.
해부 현미경에서 마이크로 리터 당 웜수를 추정합니다. 파이펫을 사용하여 각 THY 연쇄상 구균 시드 및 NGM E.coli 시드 플레이트에 약 100 L4 애벌레를 추가합니다. 박테리아의 변형 당 세 접시를 사용합니다.
섭씨 25도에서 2~3시간 동안 접시를 배양합니다. 그 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. M9W로 씻어 내고 15ml 원물 튜브로 벌레를 수집합니다.
원심 단계에서 이전에 했던 것처럼 벌레를 세 번 씻으세요. 포부로 대부분의 M9W를 제거하십시오. 그리고 마취를 위한 벌레 펠릿에 2 밀리머 나트륨 아지드 또는 테트라미솔 염산염을 포함하는 M9W의 500 마이크로리터를 추가합니다.
15 분 동안 실온에서 벌레 펠릿으로 튜브를 배양하십시오. 그런 다음, 웜 서스펜션의 15 마이크로리터를 준비된 전초 패드에 떨어뜨립니다. 형광 현미경으로 Fitzy 및 Dappy 필터를 사용하여 skn-1의 국소화를 시각화합니다.
이미지 웜은 10배, 20배 배율로 합니다. 핵 국산화가 관찰되지 않는 국소화; 낮은 국소화, 중간 국소화, SKN 1 BCGFP가 웜의 전방 또는 후방에 있는 및 모든 장 세포에서 핵 국산화가 관찰되는 높은 현지화를 기반으로 웜을 점수. 이 실험에서, 미티스 그룹의 구성원은 신속하게 S.mutans반대로, S.salivarius 및 비 병원성 대장균 OP-50반대로 벌레를 죽였다.
카탈라제가 THY 에이거로 보충되었을 때, 벌레의 학살은 폐지되었다. 웜의 죽음은 야생 형 및 칭찬 균주에 비해 델타 spxB 돌연변이 균주에서 관찰되지 않았다. 이 데이터는 Mitis Group에 의해 생성된 과산화수소가 벌레의 살인을 중재한다는 것을 건의합니다.
skn-1 녹다운 웜의 생존율이 벡터 제어 처리 웜에 비해 현저한 감소가 관찰되었다. skn-1 돌연변이 균주와 N2 야생형 웜과 유사한 살인 표현형이 관찰되었다. 이것은 skn-1이 미티스 그룹에 벌레의 생존에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.
skn-1 BCGFP의 국소화는 S 코르도나에의 델타 spxB 돌연변이 균주에 대한 응답이 아닌 야생 형 N-칭찬 균주에 노출 된 웜에서 관찰되었다. P38 맵 키나아제 통로의 성분이 쓰러진 후, skn-1 BCGFP의 국소화를 감소시키고, 벡터 제어 처리 웜에 비해 처리된 웜을 녹다운하였다. 연쇄상 구균 c를 사용 하 여.
elegans 시스템, 과산화수소가 내피 성 구균 스트레스, 미토콘드리아 손상, 미토포이 및 토포지에 미치는 영향은 더 연구 될 수 있습니다. 또한, 과산화수소가 세포의 핵심 공정을 방해하여 면역 반응을 유도하는 virilescence 인자로서 작용하는 메커니즘을 확인할 수 있다.
