3D الثقافة العضوية المعوية يحد من دراسة التفاعل الظهارية-الممرض المضيف لأن التجويف لا يمكن الوصول إليها مباشرة من البكتيريا أو عوامل الفوعة. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن بسهولة أخذ عينات من المواد المُفرزة مثل الجزيئات الصغيرة أو البروتينات أو المخاط من الثقافة ثلاثية الأبعاد لتحليل المصب. لمعالجة هذه القيود، نقدم بروتوكول معدلة لتحويل الoids الإنسان 3D أو colonoids إلى أحادية الطبقات.
monolayers القولون تفرز سميكة، طبقة المخاط apical، مما يسمح لدراسات الجسم الحي السابق للتفاعل المخاط الممرض. تهدف هذه الطريقة إلى توفير نموذج قابل للذاكرة لدراسة أقرب تفاعلات المضيفة المسببة للأمراض المعوية عند العدوى. سوف تسمح monolayers القولون لطريقة جديدة لدراسة علم الأحياء المخاط، وهو أمر مهم في التفاعل المضيف الممرض، والدراسات الميكروبيوم، ومرض التهاب الأمعاء.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أجهزة أخرى إفراز المخاط مثل الجهاز الهضمي العلوي، والجهاز التنفسي، والجهاز التناسلي للإناث. سوف مظاهرة البصرية مساعدة المستخدم مع الحفاظ على المخاط خلال نمو أحادية الطبقات وأثناء التثبيت للمناعة. إثبات الإجراء سيكون كارول دوكلادني، عالم الموظفين من مختبرنا.
بعد احتضان ثقافة الخلية المغلفة ، يُفطن متوسط الثقافة من لوحة 24 بئرًا واستبدلها بمحلول حصاد بارد من الجليد في المليلتر في البئر. استخدام مكشطة خلية صغيرة لإزاحة وتفتيت بيليه غشاء غشاء الطابق السفلي. إيلاء اهتمام خاص لأية مواد بالقرب من حواف البئر.
ثم، يهيج لوحة على شاكر المدارية في ما يقرب من 200 الثورات في الدقيقة الواحدة في أربع درجات مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. استخدم ماص قناة واحدة P200 مزودة بنصائح فلتر عقيمة لإعادة إجراء تعليق الخلية. تسليم تعليق الخلية في 15 ملليلتر قارورة مخروطية.
استخدم قوارير متعددة إذا كان إجمالي حجم التعليق أكبر من ستة ملليلترات. بعد ذلك، إضافة إلى القارورة حجم متساو من متقدمة DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 10 ملليمتر HEPES, L-ألانيل-L-الجلوتامين ديببتيد, والبنسلين-ستربتوميسين. هذا هو وسيلة الغسيل.
عكس القارورة ثلاث إلى أربع مرات لخلط. أجهزة الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. قبل طلاء الخلايا، اكويّل الزُيّاة المغلفة في حاضنة استزراع الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
لكل إدراج أن تكون مطلية، دافئة ملليلتر واحد من التوسع المتوسطة في حمام الماء 37 درجة مئوية وإضافة اثنين من مثبطات. ثم يضاف الخليط إلى الآبار. استلهمي الغسل المتوسط من الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الخلية واستبدالها بوسيط التوسع مع حجم يكفي لتحقيق ما لا يقل عن 100 ميكرولترات لكل إدراج و resuspend.
ثم، التعرق الحل الرابع الكولاجين من كل إدراج وغسل مرتين مع 150 ميكرولترات من وسط غسل لكل إدراج. ماصة 600 ميكرولترات من التوسع المتوسطة في الفضاء تحت كل إدراج. Pipette 100 ميكرولترات من تعليق الخلية من القارورة في كل إدراج.
إعادة لوحة إلى حاضنة ثقافة الأنسجة وترك دون عائق لمدة 12 ساعة على الأقل. تجنب اهتزاز أو إمالة لوحة حادة. بعد احتضان، ضع لوحة على المجهر ضوء النقيض المرحلة مع 2.5 مرات إلى 10 مرات عدسة الهدف.
تحديث مع ثقافة المتوسطة دون مثبطات لوقف العلاج تثبيط. استمر في تحديث الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى التقاء. ارفع إدراجات ثقافة الخلية من لوحة 24-well مع ملقط أو ملاقط ذات رؤوس دقيقة.
عكس بعناية على ورقة الأنسجة المختبرية لإزالة المتوسطة ونظف السائل الخارجي المتشبثة بإدراج. في لوحة جديدة 24-جيدا، تزج إدراج في حل واحد إلى ثلاثة من حمض الخليك الجليدي والإيثانول المطلق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، على مقاعد البدلاء، عكس إدراج على ورقة الأنسجة لإزالة المثبت.
ضع الإدراجات في حاوية بلاستيكية مليئة بـ 1X PBS لمدة 10 دقائق لإعادة هيدرات الخلايا قبل الشروع في بروتوكولات المناعة القياسية. للحفاظ على, استخدام شفرة حلاقة لقطع حول محيط غشاء إدراج. باستخدام ملقط، نقل الغشاء إلى شريحة المجهر الزجاجي.
ثم، إضافة المتوسطة المتصاعدة ولصق غطاء الزجاج. في هذه التجربة، تزرع الثقافات المعوية والمستعمرات البشرية كهياكل ثلاثية الأبعاد، ثم تنفصل ومجزأة للطلاء على إدراج ثقافة الخلايا المغلفة بالكولاجين-IV البشري. يتم رصد التقدم المحرز في تشكيل أحادي الطبقات على أساس يومي عن طريق المجهر الميداني الساطع وتلطيخ المناعة.
تشكل شظايا القولون المصنفة على مرشحات الإنسان-الكولاجين-IV المغلفة جزر أحادية الطبقات متعددة من يومين إلى أربعة أيام بعد البذر. وتبين كل من الإسقاط ذي الكثافة القصوى والمقطع البصري Z مع الإسقاطات المتعامدة المقابلة أن المناطق الخالية من الخلايا يمكن تحديدها من خلال عدم وجود تلطيخ F-actin النووي والأبلاسي. تم الكشف عن أحادية القولون مع سطح apical مستمر من قبل F-actin مناعة ما يقرب من أسبوع واحد بعد البذر.
التكبير عالية من عرض تمثيلي أقصى كثافة وقسم البصرية confocal مع الإسقاطات المتعامدة المقابلة تبين أن الخلايا في monolayers القولون ينق تشكل حلقات F-actin perijunctional وفرشاة غير ناضجة الحدود. EdU التأسيس يدل على فقدان تدريجي للانتشار خلال التمايز أحادية الطبقات jejunal. أحادية الطبقات الجيونلية غير المتمايزة لديها خلايا أوسع وأقصر ، وحدود فرشاة apical actin تعتمد على أقل نضجًا مقارنة بطبقات مجونة بعد خمسة أيام من التمايز.
تفتيت المستعمرات أمر بالغ الأهمية. إذا كانت الأجزاء كبيرة جداً، فإنها لن تعلق على مرشح المغلفة، ولكن بدلاً من ذلك سيتم إصلاح في colonoid 3D. لقد عرضنا طريقة معدلة لدراسة علم الأحياء المخاطي على monolayers القولون.
يمكن إجراء دراسات أخرى لمسببات الأمراض المضيفة للنظر في التفاعل بين الممرض والسطح الأمعاء.
