La coltura organoide intestinale 3D limita lo studio dell'interazione epiteliale-patogeno ospite perché il lume non è direttamente accessibile a batteri o fattori di virulenza. Inoltre, materiali secreti come piccole molecole, proteine o muco non possono essere facilmente campionati dalla coltura 3D per l'analisi a valle. Per risolvere queste limitazioni, presentiamo un protocollo modificato per convertire enteroidi o colonoidi umani 3D in un monostrato.
I monostrati colonoidi secernono uno spesso strato di muco apicico, consentendo studi ex vivo sull'interazione patogeno-muco. Questo metodo mira a fornire un modello trattabile per studiare le prime interazioni intestinali ospite-patogeno al momento dell'infezione. I monostrati colonoidi consentiranno un nuovo modo di studiare la biologia del muco, che è importante nell'interazione ospite-patogeno, negli studi sul microbioma e nella malattia infiammatoria intestinale.
Questo metodo può essere applicato ad altri organi che secernono muco come il tratto gastrointestinale superiore, il sistema respiratorio e il sistema riproduttivo femminile. La dimostrazione visiva aiuterà l'utente con la conservazione del muco durante la crescita del monostrato e durante la fissazione per l'immunosottenzione. A dimostrare la procedura sarà Karol Dokladny, uno scienziato dello staff del nostro laboratorio.
Dopo aver incubato la coltura cellulare rivestita, aspirare il mezzo di coltura dalla piastra a 24 pozzi e sostituire con una soluzione di raccolta a freddo-ghiaccio millilitro per pozzo. Utilizzare un mini raschietto per cellulari per spodestarsi e rompere il pellet della matrice della membrana del seminterrato. Prestare particolare attenzione a qualsiasi materiale vicino ai bordi dei pozzi.
Quindi, agitare la piastra su uno shaker orbitale a circa 200 giri al minuto a quattro gradi Celsius per 30-45 minuti. Utilizzare una pipetta a canale singolo P200 dotata di punte filtranti sterili per triturare la sospensione cellulare. Consegnare la sospensione cellulare in una fiala conica da 15 millilitri.
Utilizzare più flaconcini se il volume totale delle sospensioni è maggiore di sei millilitri. Successivamente, aggiungere nel flaconcino un volume uguale di mezzo DMEM/F12 avanzato contenente 10 HEPES millimolare, dipeptide L-alanil-L-glutammina e penicillina-streptomicina. Questo è il mezzo di lavaggio.
Invertire la fiala da tre a quattro volte per mescolare. Centrifuga a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Prima della placcatura cellulare, equilibrare gli inserti rivestiti in un incubatore di coltura tissutale per almeno 30 minuti.
Per ogni inserto da placcare, riscaldare un millilitro di mezzo di espansione in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e aggiungere due inibitori. Quindi, aggiungere la miscela ai pozzi. Aspirare il mezzo di lavaggio dal tubo contenente il pellet cellulare e sostituire con un mezzo di espansione con un volume sufficiente a produrre almeno 100 microlitri per inserto e resuspend.
Quindi, aspirare la soluzione collagene IV da ogni inserto e lavare due volte con 150 microlitri del mezzo di lavaggio per inserto. Pipetta 600 microlitri di mezzo di espansione nello spazio sotto ogni inserto. Pipetta 100 microlitri di sospensione cellulare dal flaconcino in ogni inserto.
Riportare il piatto nell'incubatrice di coltura tissutale e lasciare indisturbato per almeno 12 ore. Evitare di scuotere o inclinare bruscamente la piastra. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra su un microscopio leggero a contrasto di fase con una lente da 2,5 volte a 10 volte obiettiva.
Rinfrescarsi con il mezzo di coltura senza inibitori per interrompere il trattamento di inibizione. Continuare ad aggiornare il supporto ogni due o tre giorni fino a quando non è confluente. Sollevare gli inserti della coltura cellulare dalla piastra a 24 po', con pinze o pinzette a punta fine.
Invertire con cura su una carta velina da laboratorio per rimuovere il mezzo apicale e asciugare il liquido esterno aggrappato all'inserto. In una nuova piastra da 24 po' immergere gli inserti in una soluzione uno-tre di acido acetico glaciale ed etanolo assoluto per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sul banco, invertire l'inserto su carta velina per rimuovere il fissatore.
Posizionare gli inserti in un contenitore di plastica riempito con 1X PBS per 10 minuti per reidratare le cellule prima di procedere con protocolli di immunosottenzione standard. Per conservare, utilizzare una lama di rasoio per tagliare intorno al perimetro della membrana dell'inserto. Utilizzando le forcep, trasferire la membrana su uno scivolo al microscopio di vetro.
Quindi, aggiungere il supporto di montaggio e apporre un vetro di copertura. In questo esperimento, le colture enteroidi e colonidi umane vengono coltivate come strutture 3D, quindi dissociate e frammentate per la placcatura su inserti di coltura cellulare rivestiti di collagene-IV umano. L'avanzamento della formazione di monostrati viene monitorato quotidianamente tramite microscopia a campo luminoso e colorazione ad immunofluorescenza.
Frammenti di colonoidi seminati su filtri rivestiti di collagene-IV umano formano più isole monostrato da due a quattro giorni dopo la semina. Sia la proiezione ad intensità massima che la sezione Z ottica confocale con le corrispondenti proiezioni ortogonali mostrano che le aree senza cellule sono identificabili dall'assenza di colorazione F-actina sia nucleare che apicale. Un monostrato colonoide confluente con superficie apicica continua è stato rilevato dall'immunoso immunosocienza F-actina che ha raggiunto circa una settimana dopo la semina.
L'ingrandimento elevato di una proiezione rappresentativa ad intensità massima e di una sezione ottica confocale con le corrispondenti proiezioni ortogonali mostrano che le cellule nei monostrati colonoidi confluenti formano gli anelli periunzionali F-actin e un bordo del pennello apicale immaturo. L'incorporazione di EdU dimostra una progressiva perdita di proliferazione durante la differenziazione jejunal monostrato. I monostrati jejunal indifferenziati hanno cellule più ampie e corte e un bordo del pennello a base di actina apicale meno maturo rispetto ai monostrati jejunal dopo cinque giorni di differenziazione.
Frammentare i colonoidi è fondamentale. Se i frammenti sono troppo grandi, non si attaccheranno al filtro rivestito, ma si riformeranno invece in un colonoide 3D. Abbiamo presentato un metodo modificato per studiare la biologia del muco sui monostrati colonoidi.
Altri studi sull'agente patogeno ospite possono essere eseguiti per esaminare l'interazione tra l'agente patogeno e la superficie apicica intestinale.
