3D-кишечная органоидная культура ограничивает изучение взаимодействия эпителиально-патогенов хозяина, поскольку люмен не доступен непосредственно бактериям или факторам вирулентности. Кроме того, секретные материалы, такие как небольшие молекулы, белки или слизь, не могут быть легко отобраны из 3D-культуры для анализа ниже по течению. Для устранения этих ограничений мы представляем измененный протокол для преобразования 3D-энтероидов человека или колоноидов в монослой.
Колоноидные монослойные выделяет толстый, апический слой слизи, что позволяет ex vivo исследования патогенно-слизного взаимодействия. Этот метод направлен на обеспечение уротворяемой модели для изучения ранних кишечных взаимодействий хозяина-патогена после инфекции. Монослойные колоноиды позволят по-новому изучать биологию слизи, что важно при взаимодействии хозяина и патогена, исследованиях микробиома и воспалительных заболеваниях кишечника.
Этот метод может быть применен к другим органам, секретам слизи, таким как верхний желудочно-кишечный тракт, дыхательная система и женская репродуктивная система. Визуальная демонстрация поможет пользователю с сохранением слизи во время роста монослой и во время фиксации на иммуностимулятор. Демонстрацией процедуры будет Кароль Докладный, штатный ученый из нашей лаборатории.
После инкубации культуры клеток с покрытием, аспирировать культуру среды из 24-хорошо пластины и заменить один миллилитр ледяной раствор для сбора урожая на колодец. Используйте мини-скребк ячейки, чтобы выбить и разбить мембраны мембраны матрицы гранулы. Обратите особое внимание на любой материал вблизи краев колодеца.
Затем агитировать пластину на орбитальном шейкере при примерно 200 оборотов в минуту при четырех градусах по Цельсию в течение 30-45 минут. Используйте одноканальную пипету P200, оснащенную стерильными наконечниками фильтров для тритурации подвески ячейки. Доставка подвески ячейки в 15-миллилитровом коническом флаконе.
Используйте несколько флаконов, если общий объем подвески превышает шесть миллилитров. После этого, добавить во флакон равный объем Расширенный DMEM/F12 среды, содержащей 10 миллимолярд HEPES, L-аланил-L-глутамин дипептид, и пенициллин-стрептомицин. Это среда для мытья.
Инвертировать флакон три-четыре раза, чтобы смешать. Центрифуга при 300 раз г в течение 10 минут при четырех градусах цельсия. Перед покрытием клеток, equilibrate покрытием вставки в инкубаторе культуры тканей, по крайней мере 30 минут.
Для каждой вставки, которая будет поблица, тепло один миллилитр расширения среды в 37-градусной по Цельсию водяной бане и добавить два ингибитора. Затем добавьте смесь в скважины. Аспирировать средство мытья из трубки, содержащей гранулы клетки и заменить расширение среды с объемом достаточно, чтобы дать по крайней мере 100 микролитров на вставку и повторного перерасхода.
Затем, аспирировать раствор коллагена IV из каждой вставки и мыть дважды с 150 микролитров среды мытья на вставку. Pipette 600 микролитров расширения среды в пространство под каждой вставкой. Pipette 100 микролитров клеточной подвески из флакона в каждую вставку.
Вернуть пластину в инкубатор культуры тканей и оставить спокойно, по крайней мере 12 часов. Избегайте встряхивания или резкого наклона пластины. После инкубации поместите пластину на фазово-контрастный световой микроскоп с объективом 2,5-10 раз.
Освежите с средой культуры без ингибиторов для того чтобы прекратить обработку ингибирования. Продолжайте обновлять среду каждые два-три дня до слияния. Поднимите вставки клеточной культуры с пластины 24-хорошо с тонкой наконечником типсов или пинцета.
Тщательно инвертировать на бумаге лабораторной ткани, чтобы удалить апикал-среду и вытереть внешнюю жидкость, цепляющуюся за вставку. В новой 24-хорошо пластины, погрузить вставки в один-три раствора ледниковой уксусной кислоты и абсолютного этанола в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем, на скамейке, инвертировать вставку на бумагу для удаления фиксатора.
Поместите вставки в пластиковый контейнер, наполненный 1X PBS в течение 10 минут для регидратации клеток, прежде чем приступить к стандартным протоколам иммуностимуляторов. Чтобы сохранить, используйте лезвие бритвы, чтобы сократить по периметру вставки мембраны. Используя типсы, перенесите мембрану на слайд стеклянного микроскопа.
Затем добавьте монтажную среду и прикрепите крышку стекла. В этом эксперименте, человека энтероидных и колоноидных культур выращиваются как 3D структуры, а затем разобщены и фрагментированы для покрытия на человека коллагена-IV покрытием клеточной культуры вставки. Прогресс образования монослой ежедневно контролируется с помощью яркой полевой микроскопии и окрашивания иммунофлюоресценции.
Фрагменты колоноидов, посеянные на фильтрах с покрытием человека-коллагена IV, образуют несколько монослойных островов через два-четыре дня после посева. Как проекция максимальной интенсивности, так и конфокальная оптическая секция с соответствующими ортогональными проекциями показывают, что зоны, свободные от клеток, идентифицируются по отсутствию как ядерного, так и апического Окрашивания F-актина. Стечение монослойного монослоя с непрерывной апической поверхностью было обнаружено С-актином иммуностаментом примерно через неделю после посева.
Высокое увеличение репрезентативной проекции максимальной интенсивности и конфокальной оптической секции с соответствующими ортогональными проекциями показывает, что клетки в стеченных однослойных монослойах образуют периъюнкционные кольца F-актина и незрелые апические границы кисти. Включение EdU демонстрирует прогрессивную потерю распространения во время дифференциации jejunal monolayer. Недифференцированные jejunal монослой имеют более широкие, короткие клетки, и менее зрелые апические актин основе кисти границы по сравнению с jejunal монослой после пяти дней дифференциации.
Фрагментация толстой кишки имеет решающее значение. Если фрагменты слишком велики, они не будут прикрепляться к фильтру с покрытием, а вместо этого будут реформироваться в 3D колоноид. Мы представили модифицированный метод изучения биологии слизи на колоноидных монослойных.
Другие исследования хост-патогенов могут быть выполнены, чтобы посмотреть на взаимодействие между патогеном и кишечной апической поверхности.
