A cultura organoide intestinal 3D limita o estudo da interação epitelial-patógeno hospedeiro porque o lúmen não é diretamente acessível a bactérias ou fatores de virulência. Além disso, materiais secretos como pequenas moléculas, proteínas ou muco não podem ser facilmente amostrados da cultura 3D para análise a jusante. Para lidar com essas limitações, apresentamos um protocolo modificado para converter enteróides humanos 3D ou colonóides em uma monocamada.
Monocamadas colonóides secretam uma camada de muco espessa e apical, permitindo estudos ex vivo de interação patógeno-muco. Este método visa fornecer um modelo tratável para estudar as primeiras interações intestinais hospedeiros-patógenos após a infecção. Monocamadas colonóides permitirão uma nova maneira de estudar a biologia do muco, que é importante na interação hospedeiro-patógeno, estudos de microbioma e doença inflamatória intestinal.
Este método pode ser aplicado a outros órgãos que secretam muco, como o trato gi superior, o sistema respiratório e o sistema reprodutivo feminino. A demonstração visual ajudará o usuário com a preservação do muco durante o crescimento da monocamadas e durante a fixação para imunostaining. Demonstrando o procedimento estará Karol Dokladny, uma cientista do nosso laboratório.
Depois de incubar a cultura celular revestida, aspire o meio de cultura da placa de 24 poços e substitua por uma solução de colheita gelada mililitro por poço. Use um mini raspador de células para desalojar e quebrar a bala de matriz de membrana do porão. Preste especial atenção a qualquer material próximo às bordas do poço.
Em seguida, agitar a placa em um agitador orbital a aproximadamente 200 revoluções por minuto a quatro graus Celsius por 30 a 45 minutos. Use uma pipeta de canal único P200 equipada com pontas de filtro estéreis para triturar a suspensão da célula. Entregue a suspensão celular em um frasco cônico de 15 mililitros.
Use vários frascos se o volume total de suspensão for superior a seis mililitros. Depois disso, adicione ao frasco um volume igual de médio Avançado DMEM/F12 contendo 10 milimôlares HEPES, L-alanyl-L-glutamina dipeptida e penicilina-estreptomicina. Este é o meio de lavagem.
Inverta o frasco três a quatro vezes para misturar. Centrifugar a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Antes do revestimento celular, equilibre as pastilhas revestidas em uma incubadora de cultura tecidual por pelo menos 30 minutos.
Para cada inserção a ser banhada, aqueça um mililitro de meio de expansão em um banho de água de 37 graus Celsius e adicione dois inibidores. Em seguida, adicione a mistura aos poços. Aspire o meio de lavagem do tubo contendo a pelota celular e substitua por meio de expansão com um volume suficiente para produzir pelo menos 100 microliters por inserção e resuspend.
Em seguida, aspire a solução de colágeno IV de cada inserção e lave duas vezes com 150 microliters do meio de lavagem por inserção. Pipeta 600 microliters de meio de expansão no espaço abaixo de cada inserção. Pipeta 100 microliters de suspensão celular do frasco em cada inserção.
Devolva a placa à incubadora de cultura tecidual e deixe sem ser incomodado por pelo menos 12 horas. Evite balançar ou inclinar a placa bruscamente. Após a incubação, coloque a placa em um microscópio de luz de contraste de fase com uma lente de 2,5 vezes a 10 vezes objetivo.
Refrescar com meio de cultura sem inibidores para interromper o tratamento de inibição. Continue atualizando o meio a cada dois ou três dias até confluente. Levante as pastilhas de cultura celular da placa de 24 poços com fórceps ou pinças finas.
Inverta cuidadosamente em um papel de tecido de laboratório para remover o meio apical e limpar o líquido externo agarrado à inserção. Em uma nova placa de 24 poços, mergulhe as pastilhas em uma solução de um a três de ácido acético glacial e etanol absoluto por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, no banco, inverta a inserção no papel de tecido para remover o fixador.
Coloque as pastilhas em um recipiente plástico cheio de PBS 1X por 10 minutos para reidratar as células antes de prosseguir com protocolos de imunossueração padrão. Para preservar, use uma lâmina de barbear para cortar ao redor do perímetro da membrana de inserção. Usando fórceps, transfira a membrana para um deslizamento de microscópio de vidro.
Em seguida, adicione o meio de montagem e afixe um copo de cobertura. Neste experimento, culturas enteróides e colonóides humanos são cultivadas como estruturas 3D, então dissociadas e fragmentadas para chapeamento em inserções de cultura celular revestidas de colágeno-IV humanas. O progresso da formação de monocamadas é monitorado diariamente através de microscopia de campo brilhante e coloração de imunofluorescência.
Fragmentos colonóides semeados em filtros revestidos de colágeno-IV humano formam várias ilhas monocamadas de dois a quatro dias após a semeadura. Tanto a projeção de intensidade máxima quanto a seção óptica confocal com as projeções ortogonais correspondentes mostram que as áreas livres de células são identificáveis pela ausência de coloração nuclear e apical F-actin. Uma monocamada colonóide confluente com superfície apical contínua foi detectada por imunostaining F-actin aproximadamente uma semana após a semeadura.
Alta ampliação de uma projeção representativa de intensidade máxima e seção óptica confocal com as projeções ortogonais correspondentes mostram que as células em monocamadas colonóides confluentes formam os anéis perijuncionais F-actin e uma borda de pincel apical imaturo. A incorporação da EdU demonstra uma perda progressiva de proliferação durante a diferenciação de monocamadas jejunal. Monocamadas jejuais indiferenciadas têm células mais largas e mais curtas e uma borda de pincel à base de actina apical menos madura em comparação com monocamadas jejunas após cinco dias de diferenciação.
Fragmentar os colonóides é fundamental. Se os fragmentos forem muito grandes, eles não se anexarão ao filtro revestido, mas, em vez disso, se reformarão em um colono 3D. Apresentamos um método modificado para estudar a biologia do muco em monocamadas colonóides.
Outros estudos hospedeiros-patógenos podem ser realizados para analisar a interação entre o patógeno e a superfície apical intestinal.
