3D腸器官培養は、内腔が細菌または病原性因子に直接アクセスできないため、宿主上皮-病原体相互作用の研究を制限する。さらに、小分子、タンパク質、粘液などの分泌物質を3D培養から簡単にサンプリングして下流分析を行うことはできません。これらの制限に対処するために、我々は、3Dヒトエンタノイドまたはコロノイドを単層に変換するための変更されたプロトコルを提示する。
コロノイド単層は、厚い、尖体粘液層を分泌し、病原体と粘液相互作用のex vivo研究を可能にする。この方法は、感染時の最も初期の腸宿主病原体相互作用を研究するための難解なモデルを提供することを目的とする。コロノイド単層は、宿主と病原体の相互作用、マイクロバイオーム研究、および炎症性腸疾患において重要である粘液生物学を研究する新しい方法を可能にする。
この方法は、上側の消化管、呼吸器系、女性の生殖器系などの他の粘液分泌器官に適用することができる。視覚デモは、単層成長時および免疫染色の固定中に粘液保存を行うユーザーを助ける。この手順を実証することは、私たちの研究室のスタッフサイエンティスト、カロル・ドクラドニーです。
コーティングされた細胞培養液をインキュベートした後、培養液を24ウェルプレートから吸引し、ウェル当たり1ミリリットルの氷冷収穫溶液に交換する。ミニセルスクレーパーを使用して、基底膜マトリックスペレットを取り外して分解します。ウェルエッジの近くにある材料に特に注意を払ってください。
その後、約200回転/分で軌道シェーカーのプレートを30〜45分間摂氏4度で攪拌します。無菌フィルターチップを取り付けたP200単一チャネルピペットを使用して、細胞懸濁液をトリチュレートします。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐バイアルで送製します。
総懸濁液の容積が6ミリリットルを超える場合は、複数のバイアルを使用してください。その後、10ミリモルHEPES、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、およびペニシリンストレプトマイシンを含む高度なDMEM / F12培地の等量をバイアルに加えます。これは洗浄媒体です。
バイアルを3~4回反転して混ぜます。摂氏4度で10分間300倍の遠心分離機。細胞メッキの前に、コーティングされたインサーを組織培養インキュベーター内で少なくとも30分間平衡化する。
めっきする各インサートについて、37°Cの水浴で1ミリリットルの膨張培地を温め、2つの阻害剤を加える。その後、ウェルに混合物を追加します。細胞ペレットを含むチューブから洗浄媒体を吸引し、挿入および再懸濁1回あたり少なくとも100マイクロリットルを得るのに十分な体積で膨張媒体と交換する。
次いで、各インサートからコラーゲンIV溶液を吸引し、1回の挿入につき150マイクロリットルの洗浄媒体で2回洗浄する。各挿入物の下のスペースに膨張媒体のピペット600マイクロリットル。ピペット100マイクロリットルの細胞懸濁液をバイアルから各インサートへ。
プレートを組織培養インキュベーターに戻し、少なくとも12時間は邪魔されずに放置します。プレートを揺したり、急激に傾けたりすることは避けてください。インキュベート後、プレートを2.5倍から10倍の対物レンズで位相対面の軽顕微鏡に置きます。
阻害薬を使用せずに培地を用いてリフレッシュし、阻害処理を中止する。コンフルエントになるまで、2~3日ごとにメディアをリフレッシュし続けます。24ウェルプレートから、細かい鉗子またはピンセットで細胞培養インサートを持ち上げます。
実験室のティッシュペーパーを慎重に反転して、アプリカル培地を取り除き、挿入物にしがみつく外部液体を拭き取ります。新しい24ウェルプレートに、室温で10分間、氷酢酸と絶対エタノールの1〜3溶液にインサートを浸します。その後、ベンチで、挿入物をティッシュペーパーに反転させ、固定剤を取り除く。
挿入物を1X PBSで満たされたプラスチック容器に10分間入れ、細胞を水分補給してから、標準的な免疫染色プロトコルを進めます。保存するには、カミソリの刃を使用して、挿入膜の周囲を切り取ります。鉗子を使用して、膜をガラス顕微鏡スライドに移す。
次に、取り付け媒体を追加し、カバーガラスを貼り付けます。本実験では、ヒトエンテノイドおよびコロノイド培養物を3D構造として増殖させ、ヒト-コラーゲン-IVコーティング細胞培養挿入物上でメッキのために解解剖および断片化した。単層形成の進行は明視野顕微鏡と免疫蛍光染色によって日常的に監視される。
ヒト-コラーゲン-IVコーティングフィルターに播種されたコロノイド断片は、播種後2〜4日後に複数の単層島を形成する。最大強度投影とコンフォーカル光Zセクションの両方が対応する直交投影法を有し、核とアペカルFアクチン染色の欠如によって無細胞領域が識別可能であることを示している。連続した尖体表面を有するコンフルエントコロノイド単層を、F-アクチン免疫染色後約1週間で検出した。
対応する直交投影を伴う代表的な最大強度投影および共焦点光学断面の高倍率は、コンフルエントコロノイド単層の細胞がF-アクチンの接合環および未熟な有端ブラシ境界を形成することを示す。EdUの組み込みは、単層の単層分化中の増殖の進行性の喪失を示す。未分化の単層は、5日間の分化後の半元単層と比較して、より広く、短い細胞、および成熟度の低い有端アクチンベースのブラシ境界を有する。
コロノイドを断片化することは非常に重要です。断片が大きすぎると、コーティングされたフィルターに付着せず、代わりに3Dコロノイドに変身します。コロノイド単層の粘液生物学を研究するための改変法を発表した。
他の宿主病原体研究は、病原体と腸管の尖体表面との相互作用を調べるために行うことができる。
