Die 3D-Intestinalorganoidkultur schränkt die Untersuchung der Wirtsepithel-Pathogen-Wechselwirkung ein, da das Lumen für Bakterien oder Virulenzfaktoren nicht direkt zugänglich ist. Darüber hinaus können sezernierte Materialien wie kleine Moleküle, Proteine oder Schleim nicht einfach aus der 3D-Kultur für nachgelagerte Analysen abgetastet werden. Um diese Einschränkungen zu beheben, präsentieren wir ein modifiziertes Protokoll zum Konvertieren von 3D-Humanenteroiden oder Kolonoiden in eine Monoschicht.
Kolonoide Monolayer sezernieren eine dicke, apikale Schleimschicht, die Ex-vivo-Studien zur Pathogen-Schleim-Interaktion ermöglicht. Diese Methode zielt darauf ab, ein tragfähiges Modell zur Untersuchung der frühesten Darmwirt-Pathogen-Wechselwirkungen bei einer Infektion zur Verfügung zu stellen. Kolooide Monolayer ermöglichen eine neue Möglichkeit, Schleimbiologie zu studieren, was bei der Wirts-Pathogen-Interaktion, Mikrobiom-Studien und entzündlichen Darmerkrankungen wichtig ist.
Diese Methode kann auf andere Schleim-Sekretionsorgane wie den oberen GI-Trakt, das Atmungssystem und das weibliche Fortpflanzungssystem angewendet werden. Visuelle Demonstration wird dem Benutzer bei der Schleimkonservierung während des Monolayer-Wachstums und bei der Fixierung zur Immunfärbung helfen. Demonstriert wird das Verfahren von Karol Dokladny, einem Mitarbeiter unseres Labors.
Nach der Inkubation der beschichteten Zellkultur das Kulturmedium aus der 24-Well-Platte absaugen und mit einer Milliliter eiskalten Erntelösung pro Brunnen ersetzen. Verwenden Sie einen Mini-Zellschaber, um das Kellermembran-Matrix-Pellet zu lösen und aufzubrechen. Achten Sie besonders auf jedes Material in der Nähe der Brunnenkanten.
Dann, agitieren Sie die Platte auf einem Orbital-Shaker bei etwa 200 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten. Verwenden Sie eine P200-Einkanalpipette mit sterilen Filterspitzen, um die Zellsuspension zu trituieren. Liefern Sie die Zellsuspension in einer 15-Milliliter konischen Durchstechflasche.
Verwenden Sie mehrere Durchstechflaschen, wenn das Gesamtsuspensionsvolumen größer als sechs Milliliter ist. Danach fügen Sie in die Durchstechflasche ein gleiches Volumen von Advanced DMEM/F12 Medium mit 10 Millimolar HEPES, L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid und Penicillin-Streptomycin hinzu. Dies ist das Waschmedium.
Umdie durchstechern Sie die Durchstechflasche drei- bis viermal zu mischen. Zentrifuge bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Vor der Zellbeschichtung die beschichteten Einsätze in einem Gewebekultur-Inkubator mindestens 30 Minuten ausdemieren.
Für jeden zu plattierenden Einsatz einen Milliliter Ausdehnungsmedium in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad erwärmen und zwei Inhibitoren hinzufügen. Dann fügen Sie die Mischung zu den Brunnen. Das Waschmedium aus dem Rohr, das das Zellpellet enthält, ansaugen und durch ein Ausdehnungsmedium mit einem Volumen ersetzen, das ausreicht, um mindestens 100 Mikroliter pro Einsatz zu ergeben und wieder aufzuhängen.
Dann die Kollagen-IV-Lösung aus jedem Einsatz aspirieren und zweimal mit 150 Mikrolitern des Waschmediums pro Einsatz waschen. Pipette 600 Mikroliter Ausdehnungsmedium in den Raum unter jedem Einsatz. Pipette 100 Mikroliter Zellsuspension aus der Durchstechflasche in jeden Einsatz.
Geben Sie die Platte in den Inkubator der Gewebekultur zurück und lassen Sie sie mindestens 12 Stunden ungestört. Vermeiden Sie schütteln oder scharf kippen die Platte. Legen Sie die Platte nach der Inkubation auf ein Phasenkontrastlichtmikroskop mit einer 2,5-fachen bis 10-fachen Objektivlinse.
Erfrischen Sie sich mit Kulturmedium ohne Inhibitoren, um die Hemmungsbehandlung abzubrechen. Aktualisieren Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis es einfließend ist. Heben Sie die Zellkultureinsätze aus der 24-Well-Platte mit feingekippten Zangen oder Pinzetten an.
Auf einem Laborgewebepapier vorsichtig invertieren, um das apikale Medium zu entfernen und die an der Einlage festhängende externe Flüssigkeit abzuwischen. In einer neuen 24-Well-Platte die Einsätze bei Raumtemperatur 10 Minuten lang in eine ein bis drei Lösung aus Eisessigsäure und absolutem Ethanol eintauchen. Dann, auf der Bank, invertieren Sie den Einsatz auf Tissue-Papier, um das Fixativ zu entfernen.
Legen Sie die Einsätze 10 Minuten lang in einen mit 1X PBS gefüllten Kunststoffbehälter, um die Zellen zu rehydrieren, bevor Sie mit den Standard-Immunstainierungsprotokollen fortfahren. Um die Serbe zu erhalten, verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Umfang der Insert-Membran zu schneiden. Übertragen Sie die Membran mit Zangen auf ein Glasmikroskop-Dia.
Fügen Sie dann das Montagemedium hinzu und befestigen Sie ein Abdeckglas. In diesem Experiment werden menschliche enteroide und kolonoide Kulturen als 3D-Strukturen angebaut, dann dissoziiert und fragmentiert für die Beschichtung auf menschenkollagen-IV-beschichteten Zellkultureinsätzen. Der Fortschritt der Monolayer-Bildung wird täglich durch Hellfeldmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung überwacht.
Kolonoidfragmente, die auf humankollagen-IV-beschichtete Filter gesät werden, bilden zwei bis vier Tage nach der Aussaat eine mehrschichtige Insel. Sowohl die Maximalintensitätsprojektion als auch der konfokale optische Z-Abschnitt mit den entsprechenden orthogonalen Projektionen zeigen, dass zellfreie Bereiche durch das Fehlen von nuklearer und apikaler F-Actin-Färbung erkennbar sind. Eine konfluente kolooidische Monoschicht mit kontinuierlicher apikaler Oberfläche wurde durch F-Actin-Immunostainierung etwa eine Woche nach der Aussaat nachgewiesen.
Eine hohe Vergrößerung einer repräsentativen Maximalintensitätsprojektion und eines konfokalen optischen Schnitts mit den entsprechenden orthogonalen Projektionen zeigen, dass Zellen in konfluenten kolonoiden Monolayern die F-Actin-Perijunctionalringe und einen unreifen apikalen Pinselrahmen bilden. Die EdU-Eingemeindung zeigt einen fortschreitenden Proliferationsverlust während der jejunalen Monolayer-Differenzierung. Undifferenzierte Jejunal-Monolayer haben breitere, kürzere Zellen und eine weniger reife apikale, aktinbasierte Pinselgrenze im Vergleich zu jejunkalen Monolayern nach fünf Tagen Differenzierung.
Die Fragmentierung der Kolonoide ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Fragmente zu groß sind, werden sie nicht an den beschichteten Filter anhaften, sondern in ein 3D-Kolonoid eformatiert. Wir präsentierten eine modifizierte Methode zur Untersuchung der Schleimbiologie an kolonoiden Monolayern.
Andere Wirts-Pathogen-Studien können durchgeführt werden, um die Wechselwirkung zwischen dem Erreger und der Darm-apikalen Oberfläche zu untersuchen.
