תרבות אורגנואיד מעיים תלת מימדית מגבילה את המחקר של אינטראקציית אפיתל-פתוגן מארחת מכיוון שהלומן אינו נגיש ישירות לחיידקים או לגורמי ארסיות. בנוסף, חומרים מופרשים כגון מולקולות קטנות, חלבונים או ריר לא ניתן לדגום בקלות מתרבות 3D לניתוח במורד הזרם. כדי לטפל במגבלות אלה, אנו מציגים פרוטוקול שונה להמרת 3D דמויי אדם או קולונואידים למונולר.
מונואיירים קולונואידים מפרישים שכבת ריר עבה ואפיקלית, המאפשרת מחקרי ויוו לשעבר של אינטראקציה פתוגנית-ריר. שיטה זו שואפת לספק מודל למתיחה כדי ללמוד את האינטראקציות המוקדמות ביותר בין מארחי מעיים לפתוגן בעת ההדבקה. מונוליירים קולונואידיים יאפשרו דרך חדשה ללמוד ביולוגיה ריר, אשר חשוב אינטראקציה מארח-פתוגן, מחקרי מיקרוביום, ומחלות מעי דלקתיות.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על איברים אחרים מפריש ריר כגון מערכת העיכול העליונה, מערכת הנשימה, ומערכת הרבייה הנשית. הדגמה חזותית תסייע למשתמש בשימור ריר במהלך צמיחת מונולייה ובמהלך הקיבעון לכשל חיסוני. הדגמת ההליך תהיה קרול דוקלדני, מדען צוות מהמעבדה שלנו.
לאחר הדגירה את תרבות התאים הצפויה, שאפו את מדיום התרבות מהצלחת בת 24 הבאר והחלפו בתתא קציר קר כקרח אחד ל הבאר. השתמש מגרד תא מיני כדי לסלק ולשבור את גלולת מטריצת קרום המרתף. שים לב במיוחד לכל חומר ליד הקצוות היטב.
לאחר מכן, להתסיס את הצלחת על שייקר מסלולית בערך 200 מהפכות לדקה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות. השתמש פיפטה ערוץ יחיד P200 מצויד עצות מסנן סטרילי כדי triturate ההשעיה התא. לספק את ההשעיה התא בבקבוקון חרוט 15 מיליליטר.
השתמש בקבוקונים מרובים אם נפח המתלים הכולל גדול משישה מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף לתוך הבקבוקון נפח שווה של מתקדם DMEM / F12 בינוני המכיל 10 מילימולרים HEPES, L-alanyl-L-גלוטמין דיפטיד, פניצילין-סטרפטומיצין. זה מדיום הכביסה.
הפוך את הבקבוקון שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפני ציפוי התא, לצייד את המכניסים מצופה אינקובטור תרבות רקמות לפחות 30 דקות.
עבור כל הכנס להיות מצופה, חם מיליליטר אחד של מדיום התרחבות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף שני מעכבים. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת ל בארות. שאפו את מדיום הכביסה מהצינור המכיל את גלולת התא והחלפו באמצעי הרחבה בנפח מספיק כדי להניב לפחות 100 מיקרוליטרים לכל הכנסה ותוספת.
לאחר מכן, שאפו את פתרון הקולגן הרביעי מכל הכנס ושטפו פעמיים עם 150 מיקרוליטרים של מדיום הכביסה לכל הכנסה. פיפטה 600 מיקרוליטרים של מדיום התרחבות לחלל שמתחת לכל הכנסה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של השעיית תא מהבקבוקון לכל הכנס.
מחזירים את הצלחת לאנקובטור תרבות הרקמה ומשאירים באין מפריע לפחות 12 שעות. הימנע מרעידות או הטיה חדה של הצלחת. לאחר הדגירה, מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ אור ניגוד פאזה עם עדשה אובייקטיבית פי 2.5 עד פי 10.
רענן עם מדיום תרבות ללא מעכבים להפסיק את הטיפול עיכוב. ממשיכים לרענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים עד להתבלבלות. הרם את מוסיף תרבות התאים מהצלחת של 24 הבאר עם מדפים או פינצטה עדינים.
בזהירות להפוך על נייר רקמת מעבדה כדי להסיר את המדיום apical ולנגב נוזל חיצוני נצמד לתוספת. בצלחת חדשה של 24 בארות, טובלים את המכניסים בתמצית אחת עד שלוש של חומצה אצטית קרחונית ואתנול מוחלט במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, על הספסל, להפוך את הכנס על נייר טישו כדי להסיר את התיקון.
מניחים את המכניסים במיכל פלסטיק מלא PBS 1X במשך 10 דקות כדי rehydrate התאים לפני שתמשיך עם פרוטוקולים immunostaining סטנדרטי. כדי לשמר, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך סביב ההיקף של קרום הכניסה. באמצעות מדפים, להעביר את הממברנה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
לאחר מכן, מוסיפים את מדיום ההרכבה ומדביקים כיסוי. בניסוי זה, תרבויות האדם enteroid ו קולונואידים גדלים כמו מבנים 3D, אז ניתק מקוטע עבור ציפוי על תאים מצופים קולגן אדם-IV מוסיף. ההתקדמות של היווצרות monolayer מנוטרת על בסיס יומי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר וכתמים immunofluorescence.
שברי קולונואידים המוזרעים על מסננים מצופים קולגן-IV אנושי יוצרים מספר איים מונוליים יומיים עד ארבעה ימים לאחר הזריעה. הן הקרנה בעצימות מרבית והן מקטע Z אופטי קונפוקלי עם התחזיות האורתוגונליות המתאימות מראים שאזורים נטולי תאים ניתנים לזיהוי על ידי היעדר כתמי F-actin גרעיניים ואפיקליים. מונוליאר קולונואידי קונפלונטי עם משטח אפיקלי מתמשך זוהה על ידי אימונו-אקטין F-actin כיום שבוע לאחר הזריעה.
הגדלה גבוהה של הקרנה ייצוגית בעוצמה מקסימלית ומקטע אופטי קונפוקלי עם ההקרנות האורתוגונליות המתאימות מראות שתאים במונואלירים קולונואידיים קונבנציונליים יוצרים את טבעות ה- F-actin perijunctional וגבול מברשת אפית לא בוגר. התאגדות EdU מדגימה אובדן מתקדם של התפשטות במהלך ההידול המונווליאר jejunal. למונואים ג'ג'ונאליים מונואיריים בלתי מוישים יש תאים רחבים יותר, קצרים יותר, וגבול מברשת פחות בוגר המבוסס על אקטין, בהשוואה למונוליירים ג'ג'נאליים לאחר חמישה ימים של התבידול.
פיצול הקולונואידים הוא קריטי. אם הקטעים גדולים מדי, הם לא יתחברו למסנן המפופה, אלא יתקנו מחדש לקולונואיד תלת-מימדי. הצגנו שיטה מותאמת לחקר ביולוגיה ריר על מונוטלים קולונואידים.
מחקרים מארחים-פתוגנים אחרים יכולים להתבצע כדי להסתכל על האינטראקציה בין הפתוגן לבין פני השטח של המעי.
