Lümen bakteri veya virülans faktörleri için doğrudan erişilebilir değildir çünkü 3D bağırsak organoid kültürü konak epitel-patojen etkileşim çalışma sınırlar. Ayrıca, küçük moleküller, proteinler veya mukus gibi salgılanan maddeler, aşağı akım analizi için 3B kültürden kolayca örneklenemez. Bu sınırlamaları gidermek için, 3D insan enteroidlerini veya kolonoidlerini tek katmanlı dönüştürmek için değiştirilmiş bir protokol salıyoruz.
Kolonoid monolayers patojen-mukus etkileşimex vivo çalışmalar için izin, kalın, apikal mukus tabakası salgılar. Bu yöntem, enfeksiyon üzerine erken bağırsak konak-patojen etkileşimleri incelemek için çekilebilir bir model sağlamayı amaçlamaktadır. Kolonoid monolayers mukus biyolojisi çalışmak için yeni bir yol sağlayacak, hangi konak-patojen etkileşimi önemlidir, mikrobiyom çalışmaları, ve inflamatuar barsak hastalığı.
Bu yöntem üst Gi sistemi, solunum sistemi ve kadın üreme sistemi gibi diğer mukus salgılayan organlara uygulanabilir. Görsel gösteri monolayer büyüme sırasında mukus koruma ve immünboyama için fiksasyon sırasında kullanıcıyardımcı olacaktır. Prosedürü gösteren Karol Dokladny, bizim laboratuvar bir personel bilim adamı olacaktır.
Kaplanmış hücre kültürünü kuluçkaya yatırdıktan sonra, kültür ortamını 24 kuyulu plakadan aspire edin ve her kuyuda bir mililitrelik buz gibi hasat çözeltisi ile değiştirin. Yerinden çıkarmak ve bodrum membran matris pelet kırmak için bir mini hücre kazıyıcı kullanın. Kuyu kenarlarına yakın herhangi bir malzemeye özellikle dikkat edin.
Daha sonra, 30 ila 45 dakika boyunca dört santigrat derece dakikada yaklaşık 200 devrimleri bir yörünge shaker plaka ajite. Hücre süspansiyonuna triturate steril filtre uçları ile donatılmış bir P200 tek kanallı pipet kullanın. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir şişede teslim edin.
Toplam süspansiyon hacmi altı mililitreden büyükse birden fazla şişe kullanın. Bundan sonra, 10 milimolar HEPES içeren Gelişmiş DMEM/F12 orta eşit hacimli şişe içine ekleyin, L-alanyl-L-glutamin dipeptid, ve penisilin-streptomisin. Bu yıkama aracı.
Şişeyi karıştırmak için 3-4 kez ters çevirin. Santrifüj 300 kez g 10 dakika boyunca dört santigrat derece. Hücre kaplaması öncesinde, kaplamalı kesici uçları doku kültürü kuluçka makinesinde en az 30 dakika denk verin.
Her kesici uç için, 37 derece-Celsius su banyosunda bir mililitre genleşme ortamı ısıtın ve iki inhibitör ekleyin. Sonra, kuyulara karışımı ekleyin. Hücre peletini içeren tüpten yıkama ortamını aspire edin ve genleşme ortamını kesici uç başına en az 100 mikrolitre verim ve resuspend için yeterli bir hacimle değiştirin.
Daha sonra, her kesici uçtan kollajen IV çözeltisini aspire edin ve kesici uç başına 150 mikrolitre yıkama aracıyla iki kez yıkayın. Pipet 600 mikrolitre genleşme ortamı her kesici uç altındaki boşluğa. Pipet her kesici uç içine şişeden hücre süspansiyon 100 mikrolitre.
Plakayı doku kültürü kuluçka makinesine geri getirin ve en az 12 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Plakayı sallamaktan veya keskin bir şekilde eğmekten kaçının. Kuluçkadan sonra, plakayı 2,5 ila 10 kat objektif lensle faz kontrastlı ışık mikroskobuna yerleştirin.
İnhibisyon tedavisini durdurmak için inhibitörler olmadan kültür ortamı ile yenileyin. Ortam anına kadar her 2-3 günde bir ortamı yenilemeye devam edin. Hücre kültürünü ince uçlu forseps veya cımbızla 24 kuyulu plakadan kaldırın.
Apikal ortamı çıkarmak ve kesici uça tutunan dış sıvıyı silmek için laboratuvar mendil kağıdını dikkatlice ters çevirin. Yeni bir 24-well plaka, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca buzul asetik asit ve mutlak etanol bir ila üç çözelti sokulması ekler. Sonra, bankta, fiksatif kaldırmak için doku kağıt üzerine eklemek ters.
Uçları, standart immünboyama protokollerine geçmeden önce hücreleri yeniden sulandırmak için 1X PBS ile dolu plastik bir kapta 10 dakika yerleştirin. Korumak için, kesici uç membranÇevresini kesmek için bir jilet kullanın. Forceps kullanarak, bir cam mikroskop slayt membran aktarın.
Sonra, montaj ortamı ekleyin ve bir kapak cam yapıştırın. Bu deneyde, insan enteroid ve kolonoid kültürleri 3D yapılar olarak yetiştirilen, daha sonra ayrıştırılmış ve insan-kollajen-IV kaplı hücre kültürü ekler kaplama için parçalanmış. Monolayer oluşumunun gelişimi parlak alan mikroskobu ve immünoresans boyama yoluyla günlük olarak izlenir.
İnsan kollajen-IV kaplı filtreler üzerine tohumlanmış kolonoid parçaları tohumlamadan iki ila dört gün sonra birden fazla tek katmanlı ada oluşturur. Hem maksimum yoğunluklu projeksiyon hem de konfokal optik Z-kesiti ile ilgili ortogonal projeksiyonlar hücresiz alanların hem nükleer hem de apikal F-aktin boyama yokluğunda tanımlanabilir olduğunu göstermektedir. Sürekli apikal yüzeye sahip bir konfluent kolonoid monolayer F-aktin immünostaining tarafından yaklaşık bir hafta sonrası tohumlama tespit edildi.
Temsili maksimum yoğunluklu projeksiyon ve konfokal optik bölümün ilgili ortogonal projeksiyonlarla yüksek büyütmesi, konfluent kolonoid monokattaki hücrelerin F-actin periihtiyati halkaları ve olgunlaşmamış apikal fırça sınırını oluşturduğunu göstermektedir. EdU incorporation jejunal monolayer diferansiyasyon sırasında proliferasyon kaybı gösterir. Farklılaşmamış jejunal monolayers daha geniş var, kısa hücreler, ve daha az olgun apikal aktin tabanlı fırça sınırı farklılaşma beş gün sonra jejunal monolayers ile karşılaştırıldığında.
Kolonoidlerin parçalanması çok önemli. Parçalar çok büyükse, kaplamalı filtreye bağlanmaz, bunun yerine 3D kolonoide dönüşürler. Kolonoid monolayers üzerinde mukus biyolojisi çalışmak için değiştirilmiş bir yöntem sunduk.
Patojen ve bağırsak apikal yüzeyi arasındaki etkileşimi görmek için diğer konak-patojen çalışmaları yapılabilir.
