세포 내부의 유비퀴티니션 및 비비퀴티니션 반응의 복잡성을 감안할 때 정의된 정제 성분을 사용하여 체외 분석서를 확립하는 것이 중요합니다. 이것은 유비퀴티뉴션과 비비퀴티뉴션의 메커니즘을 이해하고 또한 이 반응에 책임 있는 효소를 인코딩하는 유전자와 관련되었던 돌연변이가 인간 적인 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 방법을 결정하는 것을 돕습니다. 이러한 반응을 유도하는 이러한 구성 요소의 도메인과 모티브를 식별할 수 있습니다.
우리는 또한 잠재적인 치료로 개발될 수 있는 작은 분자 억제제를 위해 스크린하기 위하여 이용될 수 있는 높은 처리량 스크린 assays를 개발할 수 있습니다. 박테리아 용액을 시작하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 A.add 25 밀리터리시스 버퍼 A의 25 밀리터를 박테리아 펠릿을 포함하는 병에 넣고 펠릿을 다시 중단하십시오. 초음파 처리를 위해 튜브에 박테리아를 함유 한 용양을 옮김.
프로브 초음파 처리기를 사용하여 30초 에서 5배 동안 70%의 출력 진폭으로 용액을 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 21, 000 배 g에서 원심 분리기. 원고에 따라 5 시간 동안 GSH 구슬로 박테리아를 배양 한 후, 빈 크로마토그래피 컬럼으로 버퍼의 10 밀리터와 함께 구슬을 전송합니다.
그런 다음, 1.5 밀리터리 A의 완충제 A를 첨가하여 25 밀리머 글루타티온을 컬럼에 넣고 중력에 의한 용출을 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 수집한다. 용출 절차를 네 번 반복 신선한 버퍼A 원고에 따라 용출 분획의 계속 처리. 시작하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 B.Mix 25 밀리터의 25 밀리터에서 His-BAP1 및 MBP-DEUBAD 박테리아 펠릿을 15 분 동안 얼음에 배양하십시오.
20분 동안 21, 000배 g에서 lysate을 원심분리합니다. lysate 원심분리 후, 병에 0.45 마이크로 미터 모공 주사기 필터를 통해 lysate을 필터링하고 니켈 NTA 구슬과 혼합. 섭씨 4도에서 5시간 동안 흔들리면 배양하세요.
그 후, 3 분 동안 25, 000 배 g에서 구슬을 회전. 파이펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브에 체퍼를 저장합니다. 구슬을 완충 B 5밀리터로 씻어내고, 20밀리머 이미다졸을 함유하고, 3분 원심분리기로 6회 세척합니다.
마지막 세척 후, 빈 크로마토그래피 컬럼에 버퍼 B의 10 밀리터트로 구슬을 전송하고 200 밀리머 이미다졸을 포함하는 버퍼 B의 1 밀리리터를 추가합니다. DTT및 EDTA를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 중력에 의한 용출을 수집합니다. 용출 절차를 네 번 반복하고 원하는 용출 된 분획을 15 밀리리터 튜브로 풀.
버퍼 C를 추가하여 용출된 복잡한 을 세 번 희석시 보입니다. 그런 다음 희석된 용출을 튜브에 준비된 아밀로오스 구슬로 옮기고 밤새 섭씨 4도에서 흔들어 서 배양합니다. 아침에는 튜브를 2, 500배에서 3분간 원심분리하고 15밀리리터 튜브에 체퍼를 유지합니다.
5 밀리터리 C의 5밀리터로 단백질 바운드 구슬을 5~6회 세척합니다. 그런 다음 500 마이크로리터의 완충제 D를 아밀로오스 아가로스 비드에 정제된 His-BAP1/MBP-DEUBAD 컴플렉스에 추가하여 50%의 비드 솔루션을 만듭니다. 50% 비드 용액의 마이크로리터 20개를 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 분석을 위해 2회 Laemmli 샘플 버퍼 20마이크로리터를 추가합니다.
향후 사용량을 위해 남은 비드 솔루션을 영하 80도에 저장합니다. HEK293T 세포를 배양한 후, 15센티미터 배양 접시에 20밀리터의 1,200만 개의 세포를 배양한 후, 하루 전에 는 트랜스펙트 전에. 하루 후, 세포 배양 후드 에서, 흡인 매체와 세럼 무료 미디어의 12 밀리터공급.
밀리리터 당 1 밀리그램에서 PEI의 63 마이크로 리터를 사용하여 pCDNA 플랫-H2A의 21 마이크로그램으로 세포를 트랜스펙트. 12시간 후에 는 중간을 완료하도록 변경합니다. 원고에 따라 세포를 수확한 후, NEM을 함유하는 완충제 E의 약 10부에서 세포 펠릿을 재보중단하고 20분 동안 얼음에 배양한다.
원심분리 후 3, 000배 g에서 5분간, 상체를 폐기하십시오. 10권의 완충제 E로 염색체 펠릿을 두 번 세척한 다음 완충F 5밀리터에서 크롬타틴을 두 번 세척하고 실온에서 10분 동안 밀리리터당 3단위의 농도로 소우주 뉴클레아제로 펠릿을 치료한다. 인큐베이션 후, 뉴클레오소피 DNA 단편의 분석을 위해 혼합물의 40 마이크로리터 알리쿼트를 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다.
페놀 클로로폼 40마이크로리터와 6배의 DNA 적재 버퍼20마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이와 2 분 동안 18, 000 배 g에서 회전. 그런 다음 DNA를 로드하기 위해 2%아가로즈 젤로 수성 상15마이크로리터를 전달합니다.
원고에 따른 반응과 원심분리를 중지한 후, 15밀리리터 튜브에서 15밀리리터 튜브에 반플래그 수지 구슬로 수용성 크로마틴 분획을 4°C에서 흔들어 보냅니다. 버퍼 G.버퍼 G.Transfer 5 밀리터링 G로 구슬을 빈 크로마토그래피 컬럼으로 6번 세척합니다. 비드의 바운드 뉴클레오소좀을 260 마이크로리터의 완충G로 희석하여 깃발 용출 펩타이드의 밀리리터당 200 마이크로그램, pH 8에서 1~5개의 어금니 트리를 함유한다.
차가운 방에서 한 시간, 세 번 뉴클레오좀을 엘ute. 유비퀴티닝 분석법을 수행하기 위해 먼저 정제뉴클레오종의 마이크로그램 1개를 버퍼 H.After에 추가하여 UBE1 250 나노그램, UB 및 E2 UB의 나노그램 250나노그램을 함유한 효소 용액 믹스를 추가하여 효소를 결합하고 BMI1-RING1B E3 의 마이크로그램을 복합 튜브에 결합하였다. 37도에서 3시간 동안 반응을 배양하여 가끔 씩씩한 흔들림을 가합니다.
2회 Laemmli 샘플 버퍼의 40 마이크로리터를 첨가하여 반응을 멈추고 서부 블로팅에 의한 히스톤 H2AK119 유비퀴티네이션을 분석한다. 시험관 내 비비퀴티네이션 분석체를 수행하기 위해 정제된 뉴클레오소이소40 마이크로리터의 완충제 I및 박테리아의 1마이크로그램이 정제된 그의-BAP1/MBP-DEUBAD 구슬을 정제하였다. 튜브를 37°C의 인큐베이터에 놓아 가끔 씩 씩씩하게 흔들리는 비비퀴티니션 반응을 수행합니다.
그런 다음 2회 Laemmli 버퍼의 40 마이크로리터를 첨가하여 반응을 멈추고 면역 블로팅에 의해 분석한다. 이 실험에서, GST 선호도 구슬을 사용하여 GST-BM1-RING1B 단지의 전형적인 정화를 위한 쿠마시 블루 염색은 밴드가 각각 약 45킬로달톤과 13킬로달톤의 예상 어금니 무게로 이동하는 것을 보여준다. 마찬가지로 His-BAP1 MBP-DEUBAD 단지의 정화는 각각 90킬로달톤과 55킬로달톤의 밴드로 비교적 높은 균질성 제제를 낳았다.
한편, 정제된 뉴클레오소말 분획은 본질적으로 147개의 염기 쌍 대역에 의해 구성되어 고농축 단핵소말 분획의 존재를 나타낸다. 정제된 뉴클레오좀의 쿠마시 블루 염색은 스토이치오메트릭 양을 가진 4개의 히스톤 서브유닛의 전형적인 밴드 패턴을 나타낸다. BMI1-RING1B 복합체를 가진 히스톤 H2A의 유비퀴티뉴션은 비수정 형태의 수준이 수반적으로 감소하는 동안 단백질의 유비쿼터티드 형태의 시간 의존적 증가를 나타낸다.
유비퀴티온 반응은 거의 모든 H2A 단백질이 H2A K119ub로 변환됨에 따라 총이다. 한편, 귀비퀴틴화 분석은 토착 뉴클레오좀을 실시했다. BAP1-DEUBAD를 가진 이들 뉴클레오좀의 배큐베이션에 따라 H2A K119ub 신호의 시간 의존적 감소가 관찰되었다.
유비퀴틴화 및 비비퀴틴화 반응의 성공은 단백질이 정제되는 방식에 달려 있습니다. 우리는 좋은 수율이 필요하고 단백질 재서스펜션 및 정제를 위한 완충제 사용은 생화학 반응과 호환되어야 합니다. 이 유비퀴티뉴션 및 비비퀴티니션 어약이 잘 확립되면 영향 활성제 및 억제제뿐만 아니라 질병 관련 유전자 돌연변이의 영향을 테스트할 수 있습니다.
이 방법은 여러 실험실의 기여에 의해 설립되었으며 유비쿼터티및 비쿼터티니션의 메커니즘을 이해하는 데 매우 유용합니다. 몇몇 화학 물질은 유해하고 후드에서 조작될 필요가 있습니다. 여기에는 페놀 클로로폼, 산, 염기 및 감소제가 포함됩니다.
