Dada a complexidade das reações de ubiquização e deubiquitina dentro das células é importante estabelecer ensaios in vitro com componentes purificados definidos. Isso ajuda a entender os mecanismos de ubiquização e desubiquização e também determinar como mutações associadas a genes que codificam as enzimas responsáveis por essa reação podem causar doenças humanas. Podemos identificar os domínios e motivos nesses componentes que impulsionam essas reações.
Também podemos desenvolver ensaios de tela de alto rendimento que podem ser usados para testar inibidores de pequenas moléculas que podem ser desenvolvidos como potenciais terapêuticos. Para iniciar a lise bacteriana, adicione o TPM e o coquetel antiprotease no tampão de lise gelada A.Adicione 25 mililitros do tampão de lise A na garrafa contendo pelotas de bactérias e resuspenque a pelota. Transfira o lysato contendo bactérias em um tubo para sônicação.
Use um sonicador de sonda para sonicar a amplitude de saída de 70% durante 30 segundos, quatro a cinco vezes. Em seguida, centrífuga a 21.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois de incubar o lise de bactérias com contas GSH por cinco horas de acordo com o manuscrito, transfira as contas junto com 10 mililhadores de tampão em uma coluna de cromatografia vazia.
Em seguida, adicione 1,5 milileiros de tampão A contendo glutationa de 25 mililitros na coluna e colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro. Repita o procedimento de elução quatro vezes com tampão fresco A um tratamento contínuo das frações elucidadas de acordo com o manuscrito. Para começar, resuspenco as pelotas de bactérias His-BAP1 e MBP-DEUBAD em 25 mililteiros de tampão de lise gelada B.Misture 25 mililteiros de cada lise e incubar no gelo por 15 minutos.
Sonicize e depois centrifufique o lise a 21.000 vezes g por 20 minutos. Após a centrifugação de lise, transfiltre o lysato através de um filtro de seringa porosa de 0,45 micrômetro em uma garrafa e misture-o com as contas nickel NTA. Incubar a quatro graus Celsius com agitação por cinco horas.
Depois disso, gire as contas a 25.000 vezes g por três minutos. Use uma pipeta para salvar o supernatante em um tubo de 50 mililitros enquanto o fluxo passa. Lave as contas com cinco milileiros de tampão B, contendo 20 milimidazol, seis vezes com centrífuga de três minutos.
Após a última lavagem, transfira as contas com 10 mililitros de tampão B em uma coluna de cromatografia vazia e adicione um mililitro de tampão B contendo 200 milimidazol. Colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro contendo DTT e EDTA. Repita o procedimento de eluição quatro vezes e acumule as frações elucidadas desejadas em um tubo de 15 mililitros.
Adicione o tampão C para diluir o complexo elucido três vezes. Em seguida, transfira a elução diluída para as contas de amilolose preparadas em tubos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Pela manhã, centrifufique os tubos a 2.500 vezes g por três minutos e mantenha o supernasal em um tubo de 15 mililitros como fluxo através.
Lave as contas ligadas à proteína com cinco milileiros de tampão C por cinco a seis vezes. Em seguida, adicione 500 microliters de buffer D ao complexo purificado His-BAP1/MBP-DEUBAD nas contas agarose amilose para fazer uma solução de contas de 50%. Transfira 20 microliters da solução de 50% de contas para um tubo de microcentrifuuga e adicione 20 microliters de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli para análise azul SDS-PAGE e Coomassie.
Armazene a solução de contas restante a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Após a cultura das células HEK293T, placa 12 milhões de células em 20 milímetros de mídia completa em um prato de cultura de 15 centímetros, um dia antes da transfecção. Depois de um dia, sob o capô da cultura celular, aspirar mídia e fornecer com 12 mililitros de mídia livre de soro.
Transfeito as células com 21 microgramas de pCDNA flat-H2A usando 63 microliters de PEI a um miligrama por mililitro. Após 12 horas, mude para meio completo. Após a colheita das células de acordo com o manuscrito, resuspenha a pelota celular em cerca de 10 volumes de tampão E contendo NEM para inibir deubiquitinases e incubar no gelo por 20 minutos.
Após centrifugação a 3.000 vezes g por cinco minutos, descarte o supernasce. Lave a pelota de cromatina duas vezes com 10 volumes de tampão E primeiro e depois lave duas vezes com tampão F.Resuspende a cromatina em cinco mililteiros de tampão F e trate a pelota com nuclease microcócica na concentração de três unidades por mililitro por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, transfira uma alíquota de 40 microliter da mistura para um tubo de 1,5 mililitro para análise de fragmentos de DNA nucleosômicos.
Adicione 40 microliters de fenol-clorofórmio e 20 microliters de seis vezes tampão de carregamento de DNA. Vórtice e gire a 18.000 vezes g por dois minutos. Em seguida, transfira 15 microliters da fase aquosa em um gel de 2% de agarose para carregar o DNA.
Depois de parar a reação e a centrifugação de acordo com o manuscrito, incubar a fração de cromatina solúvel com contas de resina anti-bandeira em um tubo de 15 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Lave as contas seis vezes com o buffer G.Transfira as contas com cinco mililitros de tampão G em uma coluna de cromatografia vazia. Diluir os nucleossomos ligados da conta com 260 microliters de buffer G contendo 200 microgramas por mililitro de peptídeo de eluição de bandeira e um a cinco tris molares em pH oito.
Elute o nucleossomo três vezes, uma hora na sala fria. Para realizar o ensaio de ubiquização, adicione primeiro um micrograma dos nucleosómos purificados em 40 microliters de tampão H.Depois disso, adicione uma mistura de solução enzimática contendo 250 nanogramas de UBE1, 672 nanogramas de enzimas conjugais UB e E2 UBting e um micrograma de BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase no tubo. Incubar a reação por três horas a 37 graus Celsius com agitação ocasional.
Pare a reação adicionando 40 microlitadores de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli e analise a ubiquitina histone H2AK119 por mancha ocidental. Para realizar o ensaio de deubiquitina in vitro, resuspenja os nucleossomos purificados em 40 microliters de tampão I e um micrograma de bactérias purificadas Contas His-BAP1/MBP-DEUBAD. Coloque o tubo em uma incubadora a 37 graus Celsius durante três horas para realizar a reação de deubiquitinação com agitação ocasional.
Em seguida, pare a reação adicionando 40 microliters de duas vezes tampão Laemmli e analise por imunoblotação. Neste experimento, a coloração azul coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BM1-RING1B usando contas de afinidade GST, mostra que as bandas migram em peso molar esperado em torno de 45 kilodaltons e 13 kilodaltons, respectivamente. Da mesma forma, a purificação do complexo His-BAP1 MBP-DEUBAD também resultou em preparações homogêneas relativamente altas com bandas em torno de 90 kilodaltons e 55 kilodaltons, respectivamente.
Por outro lado, a fração nucleossômica purificada é essencialmente composta por uma faixa de par de 147 bases indicando a presença de fração mononucleosômica altamente enriquecida. A coloração azul coomassie de nucleosósmos purificados mostra um padrão típico de banda das quatro subunidades histonas com quantidades estequiométricas. A ubiquiinação da histona H2A com o complexo BMI1-RING1B mostra um aumento temporal dependente da forma ubiquitinada da proteína, enquanto os níveis da forma não modificada são concomitantemente diminuídos.
A reação de ubiquização é total, pois praticamente todas as proteínas H2A são transformadas em H2A K119ub. Por outro lado, foi realizado ensaio de deubiquitina. Após a incubação desses nucleosósmos com BAP1-DEUBAD foi observada uma redução temporal dependente do sinal H2A K119ub.
O sucesso das reações de ubiquização e deubiquitina dependem da forma como a proteína é purificada. Precisamos de um bom rendimento e o uso de tampão para ressuspensão e purificação de proteínas deve ser compatível com reações bioquímicas. Quando este ensaio de ubiquitina e deubiquitina são bem estabelecidos podemos testar os ativadores e inibidores de afeto, bem como o impacto de mutações genéticas associadas à doença.
Este método foi estabelecido pela contribuição de diversos laboratórios e são muito úteis para compreender os mecanismos de ubiquização e desubiquização. Vários produtos químicos são perigosos e precisam ser manipulados no capô. Isso inclui fenol-clorofórmio, ácidos, bases e agentes redutos.
