鉴于细胞内泛化和脱归反应的复杂性，使用定义的纯化成分建立体外测定非常重要。这有助于理解泛化和脱泛化的机制，并确定与编码负责这种反应的酶的基因相关的突变如何导致人类疾病。我们可以识别驱动这些反应的这些组件中的域和图案。
我们还可以开发高通量的屏幕检测，可用于筛选小分子抑制剂，这些抑制剂可以开发为潜在的治疗方法。要开始细菌解菌，将PMSF和抗蛋白鸡尾酒加入冰冷解液缓冲液 A.将25毫升的解菌缓冲液 A加入含有细菌颗粒的瓶子中，然后重新释放颗粒。将含有细菌的利酸盐转移到管中进行声波化。
使用探针声波器以 70%输出振幅对酸盐进行声波化，30 秒，4 到 5 次。然后在摄氏4度下以21，000次g离心20分钟。根据手稿，将细菌与GSH珠子分离5小时后，将珠子连同10毫微缓冲液一起转移到空色谱柱中。
然后，将含有25毫毛托美的1.5毫安第安进柱中，通过重力将洗脱收集到1.5毫升微管中。使用新鲜缓冲器重复洗脱过程四次 A 根据手稿继续处理洗脱分数。首先，在25毫升的冰冷解液缓冲液B.Mix中重新填充Sss-BAP1和MBP-DEUBAD细菌颗粒，并在冰上孵育15分钟。
声波化，然后以21，000倍g离心20分钟。离化离心后，通过0.45微米孔注射器过滤器过滤回乳，放入瓶子中，与镍NTA珠混合。在4摄氏度下孵育，摇晃5小时。
之后，以25，000次g旋转珠子三分钟。使用移液器将上经器保存在 50 毫升管中，以流经。用5毫微缓冲B洗涤珠子，含有20毫摩尔，用3分钟离心机洗六次。
上次洗涤后，将含有 10 毫微缓冲液 B 的珠子转移到空色谱柱中，并加入含有 200 毫摩尔 imidazole 的一毫升缓冲液 B。将重力洗脱收集成含有DTT和EDTA的1.5毫升微管。重复洗脱步骤四次，将所需的洗脱分数汇集到 15 毫升管中。
添加缓冲区 C 以稀释洗小的复合物三次。然后将稀释的洗脱转移到管中准备好的阿米洛塞珠中，并在四摄氏度下孵育，并摇动。早晨，将管以2，500次g离心三分钟，将上经液留在15毫升管中，作为流经。
用五毫的缓冲C清洗蛋白质结合的珠子五至六次。然后将500微升缓冲器D添加到紫化的Ss-BAP1/MBP-DEUBAD复合物上，在阿米洛塞阿加罗斯珠上制造50%珠子溶液。将 50% 珠子溶液的 20 微升转移到微离心管中，并添加 20 微升的 2 倍 Laemmli 样品缓冲液，用于 SDS-PAGE 和库马西蓝色分析。
将剩余的珠子溶液存放在零下 80 摄氏度，供将来使用。在培养 HEK293T 细胞后，在 15 厘米培养皿中，在转染前一天，在 20 毫微全培养基中培养 1200 万个细胞。一天后，在细胞培养罩下，吸气培养素，并供应12毫微的血清自由培养素。
使用63微升PEI以每毫升1毫克的速度，用21微克的pCDNA平-H2A对细胞进行转染。12 小时后，更改为完成介质。根据手稿采集细胞后，将细胞颗粒重新填充在约10卷含有NEM的缓冲液E中，以抑制脱皮酶，并在冰上孵育20分钟。
在3000次g下离心5分钟后，丢弃上经剂。先用10卷缓冲液E洗两次染色质颗粒，然后用缓冲液F.用5毫微量的缓冲液中重新暂停染色质，并在室温下以每毫升3个单位的浓度处理微球蛋白酶，10分钟。孵育后，将混合物的40微升等分转移到1.5毫升管中，以分析核糖体DNA片段。
加入40微升苯酚氯仿和20微升6倍DNA加载缓冲液。漩涡和旋转在18，000次g两分钟。然后在2%的加糖凝胶中转移水相的15微升，以加载DNA。
根据手稿停止反应和离心后，在4摄氏度的15毫升管中用抗旗树脂珠孵育可溶性染色质分数，并摇动。用缓冲器 G 洗六次珠子，用五毫的缓冲 G 将珠子转移到空色谱柱中。用260微升缓冲G稀释珠子的束缚核糖体，每毫升旗洗肽含有200微克，在pH8下含有1至5个摩尔三叶草。
将核糖体吸三次，在寒冷的房间里一小时。为了进行泛化测定，首先在40微升缓冲液H中加入一微克纯化核糖体，然后加入含有250南片的UB1、672纳米的UB和E2 UB结合酶和1微克BB1-1B-1B E3泛素连结酶复合物的酶溶液混合物。在37摄氏度下孵育反应3小时，偶尔摇晃。
通过添加 40 微升两次 Laemmli 样品缓冲液，并分析西印的组蛋白 H2AK119 泛光，从而停止反应。进行体外脱比化测定，在40微升缓冲液一和1微克细菌纯化的Ss-BAP1/MBP-DEUBAD珠体中重新填充纯化的核糖体。将管子放在37摄氏度的培养箱中3小时，进行偶尔摇晃的脱泛反应。
然后通过添加40微升两倍莱姆利缓冲液，通过免疫印迹进行分析来停止反应。在这个实验中，使用GST亲和珠对GST-BM1-RING1B复合物的典型纯化进行库马西蓝色染色表明，波段在预期摩尔重量下迁移，分别约为45千达吨和13千陀吨。同样，His-BAP1 MBP-DEUBAD复合物的纯化也导致相对高的同质制剂，带子分别约为90千吨和55千元。
另一方面，纯化核子体分数基本上由147基对带组成，表明存在高度富集的单核细胞分。纯核素的库马西蓝色染色显示了四个组蛋白亚单位的典型波段模式，具有计量量。组蛋白H2A与BMI1-RING1B复合物的泛化表明蛋白质泛素形式的时间依赖性增加，而非MODATED形式的水平同时降低。
泛向反应是总的，因为几乎所有的H2A蛋白都转化为H2A K119ub。另一方面，对本土核糖体进行了非泛化测定。这些核糖体与BAP1-DEUBAD孵育后，观察到H2A K119ub信号的时间依赖性减少。
泛化和去泛化反应的成功取决于蛋白质的纯化方式。我们需要良好的产量，蛋白质再依赖和纯化的缓冲液应与生化反应相容。当这种泛化和去泛化检测已经建立，我们可以测试影响激活剂和抑制剂，以及疾病相关基因突变的影响。
该方法由几个实验室的贡献建立，对了解泛化和非泛化机制非常有用。几种化学品是危险的，需要在发动机罩中操作。这包括苯酚氯仿、酸、碱和还原剂。
