ユビキチン化および細胞内のデュビキチン化反応の複雑さを考えると、定義された精製成分を用いたインビトロアッセイを確立することが重要である。これは、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解し、また、この反応を担う酵素をコードする遺伝子に関連する突然変異がヒト疾患を引き起こす方法を決定するのに役立ちます。これらの反応を促進するこれらの成分のドメインとモチーフを特定することができます。
また、潜在的な治療薬として開発できる低分子阻害剤のスクリーニングに使用できる高スループットスクリーンアッセイを開発することもできます。細菌のリシスを開始するには、氷冷リシスバッファーAにPMSFと抗プロテアーゼカクテルを追加します。超音波処理のためにチューブ内の細菌を含むライセートを転送します。
プローブ超音波処理器を使用して、30秒、4〜5回、70%出力振幅でlysateを超音波処理します。その後、摂氏4度で20分間21,000倍gで遠心分離機。原稿に従って5時間GSHビーズで菌溶解物をインキュベートした後、10ミリルターのバッファーとともにビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。
次に、25ミリモルグルタチオンを含む緩衝液Aの1.5ミリルターをカラムに加え、重力による溶出を1.5ミリリットルマイクロチューブに集める。新鮮な緩衝液Aを用いて、その溶出手順を原稿に従って溶出した分画の継続処理を4回繰り返す。まず、氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターの氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターでHis-BAP1とMBP-DEUBAD細菌ペレットを再中断し、氷の上で15分間インキュベートします。
ソニッケートし、20分間21,000回gでリセートを遠心分離します。遠心分離を取り付けた後、0.45マイクロメートルの細孔注射器フィルターを通してリセートをボトルにフィルターし、ニッケルNTAビーズと混ぜます。5時間揺れで摂氏4度でインキュベートします。
その後、ビーズを25,000回gで3分間回転させます。ピペットを使用して、流れとして50ミリリットルのチューブに上清を保存します。20ミリモルイミダゾールを含むバッファーBの5ミリルターでビーズを洗浄し、3分間の遠心分離機で6回。
最後の洗浄後、10ミリルターのバッファーBを含むビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、200ミリモルイミダゾールを含む緩衝液Bの1ミリリットルを加える。DTTおよびEDTAを含む1.5ミリリットルマイクロチューブに重力による溶出を収集する。溶出手順を4回繰り返し、所望の溶出した分画を15ミリリットルのチューブにプールします。
緩衝液Cを加え、溶出した複合体を3回希釈する。その後、希釈した溶出液をチューブ内の準備されたアミロースビーズに移し、振盪で摂氏4度で一晩インキュベートします。午前中、チューブを2、500回gで3分間遠心し、流れとして15ミリリットルチューブに上清を保ちます。
5ミリルターのバッファーCでタンパク質結合ビーズを5〜6回洗浄します。次に、精製されたHis-BAP1/MBP-DEUBAD複合体に500マイクロリットルのバッファーDをアミロースアガロースビーズに加え、50%ビーズ溶液を作ります。50%ビーズ溶液の20マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移し、SDS-PAGEおよびクマシーブルー分析のために2倍のレムリサンプルバッファーの20マイクロリットルを加えます。
将来の使用のためにマイナス80°Cで残りのビーズ溶液を保管してください。HEK293T細胞を培養した後、トランスフェクションの1日前の15センチメートル培養皿で完全培地20ミリルターに1200万個の細胞をプレートする。1日後、細胞培養フードの下で、吸気培地を12ミリルターの無血清培地で供給する。
1ミリリットル当たり1ミリグラムで63マイクロリットルのPEIを使用して、21マイクログラムのpCDNAフラットH2Aで細胞をトランスフェクトする。12時間後、培地を完了するように変更します。原稿に従って細胞を収穫した後、NEMを含む約10体積の緩衝E中の細胞ペレットを再懸濁して、デュビキチナーゼを阻害し、氷上で20分間インキュベートする。
3,000回gで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。クロマチンペレットを10容量のバッファーEで2回洗浄し、次にバッファーFで2回洗浄し、クロマチンをバッファーFの5ミリルターで再懸濁し、マイクロコッカスヌクレアーゼでペレットを1ミリリットル当たり3単位の濃度で室温で10分間処理します。インキュベーション後、ヌクレオソームDNA断片を分析するために、混合物の40マイクロリットルのアリコートを1.5ミリリットルチューブに移す。
40マイクロリットルのフェノールクロロホルムと20マイクロリットルの6倍のDNAローディングバッファーを加えます。渦と2分間18,000回gで回転する。次に、2%アガロースゲルで水相の15マイクロリットルを転写し、DNAをロードする。
原稿による反応と遠心分離を停止した後、可溶クロマチン分率を15ミリリットルチューブに一晩振盪して摂氏4度でインキュベートする。バッファーGでビーズを6回洗い、5ミリルターのバッファーGを持つビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。ビーズ結合型ヌクレオソームを、フラグ溶出ペプチドの1ミリリットル当たり200マイクログラム、pH 8で1~5モルトリスを含む260マイクロリットルの緩衝Gで希釈します。
冷たい部屋で3回、1時間のヌクレオソームをエルクする。ユビキチン化アッセイを行うために、まず精製されたヌクレオソームのマイクログラムを40マイクロリットルのバッファーHに追加し、その後、UBE1の250ナノグラム、UBおよびE2 UB結合酵素の672ナノグラムおよびBMI1-RING1B E3ユビキチンリガー複合体の1マイクログラムを含む酵素溶液ミックスを加える。時折揺れで摂氏37度で3時間反応をインキュベートします。
2回のLaemmliサンプルバッファーの40マイクロリットルを加えることによって反応を停止し、ウェスタンブロッティングによるヒストンH2AK119ユビキチン化を分析します。インビトロ・デュビキチン化アッセイを行うために、精製されたヌクレオソームを40マイクロリットルのバッファーIおよび1マイクログラムの細菌で再懸濁し、His-BAP1/MBP-DEUBADビーズを精製した。チューブを摂氏37度のインキュベーターに3時間置き、時折揺れでデュービキチン化反応を行います。
次に、2回のレムリバッファーの40マイクロリットルを加えて反応を停止し、免疫ブロッティングにより分析します。この実験では、GST-BM1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色は、GSTアフィニティービーズを使用して、バンドがそれぞれ約45キロダルトンと13キロダルトンの周りに予想モル重量で移動することを示しています。同様に、His-BAP1 MBP-DEUBAD複合体の精製は、それぞれ約90キロダルトンと55キロダルトンのバンドを有する比較的高い均質製剤をもたらした。
一方、精製されたヌクレオソーム画分は、本質的には、高濃縮単核体画分の存在を示す147塩基対バンドによって構成される。精製されたヌクレオソームのクマシーブルー染色は、量論量を有する4つのヒストンサブユニットの典型的なバンドパターンを示す。BMI1-RING1B複合体を有するヒストンH2Aのユビキチン化は、非修飾形態のレベルが付随的に減少している間にタンパク質のユビキチン化形態の時間依存性の増加を示す。
ユビキチン化反応は、事実上すべてのH2Aタンパク質がH2A K119ubに変換されるため、合計です。一方、デュビキチン化アッセイは、天然核組を実施した。これらのヌクレオソームをBAP1-DEUBADでインキュベートした後、H2A K119ubシグナルの時間依存的な減少が観察された。
ユビキチン化およびデュビキチン化反応の成功は、タンパク質の精製方法によって異なります。我々は良好な収量を必要とし、タンパク質の再懸濁および精製のための緩衝剤の使用は生化学的反応と互換性があるべきである。このユビキチン化およびデュービキチン化アッセイが十分に確立されている場合、我々は影響活性化剤および阻害剤ならびに疾患関連遺伝子突然変異の影響をテストすることができる。
この方法は、いくつかの実験室の貢献によって確立されており、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解するのに非常に有用である。いくつかの化学物質は危険であり、フード内で操作する必要があります。これには、フェノールクロロホルム、酸、塩基、還元剤が含まれる。
